一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用的制作方法
【专利摘要】发明的目的是提供一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用，所述的miRNA为miR-204-5p，其RNA序列为SEQ?ID?NO:1。该miRNA基因产物能够调节SMAD4基因的表达，阻断TGF-β／Smads信号通路，抑制上皮-间质转化(EMT)，具有制备用于后发性白内障PCO诊疗制品的潜力。
【专利说明】—种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用
[0001]本发明要求申请日为2012年12月27日，申请号为201210579895x，发明名称为:用于白内障相关miRNA的筛选的发明申请的优先权。
【技术领域】
[0002]本发明属于基因诊断与治疗的相关【技术领域】，具体涉及miR-204_5p在制备检测后发性白内障诊疗制品中的应用。
[0003]发明背景
[0004]后发性白内障(PCO)又称后囊膜混浊，是指白内障囊外摘除术后，或外伤性白内障部分皮质吸收后所形成的晶状体后囊膜混浊。它是白内障摘除术后最常见的并发症，在成人，术后发生率为30%~50%，在儿童则为100%。随着白内障超声乳化术的开展，后发性白内障已成为影响白内障术后视力恢复的主要因素。白内障术后的创伤修复、残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)增生、迁移、上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)、胶原沉积、残留 LECs 的晶状体纤维再生是白内障术后形成后发障的主要原因。目前针对后发性白内障的发病机理的研究较多，但在临床和药物干预方面仍缺乏安全、有效的手段减少PCO的发生。PCO —旦发生，通常采用Nd:YAG激光后囊膜切开术治疗，不仅费用昂贵，而且有视网膜脱离、黄斑水肿、虹膜出血等并发症的发生。药物治疗方面，目前眼内植入药物缓释装置是防治后发性白内障较为理想的给药方式，但是药物缓释装置中，药物浓度效应控制、作用范围、靶向性依然有待提高。已有研究表明，TGF-B可诱导a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a_SMA)、波形蛋白(Vimentin)、上皮型E-钙粘蛋白(E-Cadherin)等与EMT相关目的基因的表达，诱导LECs发生EMT。而TGFP / Smads信号传导系统在角膜的形成发育、角膜和晶状体创伤后的修复、后发性白内障中均起着至关重要的作用。通过调节Smad蛋白可以影响眼部组织的创伤愈合和纤维化程度。因此阻断TGF-P / Smads信号通路可能成为PCO新的治疗方法。这就需要获得能够调节Smad蛋白的有效的miRNAs。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用，所述的miRNA为miR-204-5p，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 申请人:通过对后发性白内障的囊膜芯片进行分析，发现miR-204_5p的表达量显著下调，且miR-204-5p参与后发性白内障PCO病程中靶基因SMAD4的调节，从而促成了本发明。
[0007]本发明的miRNA，为 has-miR-204_5p，其核酸序列为 SEQ ID NO:1 ；
[0008]本发明的miRNA，能够调节Smad基因的表达；
[0009]本发明还提供miR-204_5p或其模拟物(miR-204_5p mimic)的新的用途,是用于制备后发性白内障PCO的诊疗制品；
[0010]所述的制品为药物，该药物包含有药理有效含量的has-miR-204-5p或其模拟物。[0011]本发明提供了一种能用于治疗后发性白内障的miRNA。has-miR-204_5p能够调节Smad的表达,通过阻断TGF-0 / Smads信号通路,影响白内障术后的创伤修复、抑制上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和残留 LECs 的晶状体纤维再生等，可能成为治疗PCO的新方法，具有制备用于后发性白内障PCO诊疗制品的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:qRT-PCR分析正常人和后发性白内障患者LECs miR-31, miR-182,miR-204-5p的相对表达量的变化图；显示后发性白内障患者(PCO) LECs中miR-31，miR-182，miR-204-5p 的表达显著下调(P〈0.05)；
[0013]图2:miR-204-5p靶基因为SMAD4且显著下调SMAD4的表达图，其中A为miR-204-5p结合在SMAD4的3_UTR2880_2887bp区域；B为体外培养人晶体囊袋模型LECs转染 pGL3-SMAD4、pGL3-control、miR-204-5pmimic+Mut-pGL3-SMAD4-3，-UTR、miR-204_5pmimic+pGL3-SMAD4-3’ -UTR 和 miR-204_5p mimic+pGL3-SMAD4_3’ -UTR 后，海肾荧光素酶报告酶基因表达情况；C为miR-204-5p下调SMAD4蛋白的表达(上图为western blotting结果图，下图为GAPDH标准化后的结果)。泳道1:正常培养3天的囊袋LECs;泳道2:转染 miR-204_5p mimic control 的囊袋 LECs ;泳道 3:转染 miR-204_5p mimic 的囊袋 LECs ；泳道 4:转染 miR-204_5p inhibitor 的囊袋 LECs ；
[0014]图3:EMT标记物E-cadherin, a_SMA, Vimentin在后发性白内障PCO组织中的表达；Normal为正常人囊袋材料；PC0为后发型白内障患者囊袋材料；
[0015]图4:体外培养正常人囊袋LECs过量表达miR-204-5p mimic和miR-204_5pinhibitor 后 EMT marker 基因的表达。
【具体实施方式】
[0016] 申请人:通过对后发性白内障手术患者和正常供体晶体囊膜材料芯片分析发现，miR-204-5p(等同于has-miR-204-5p)在后发性白内障手术患者晶体囊膜中显著下调，并通过qRT-PCR验证这一结果。同时发现miR-204-5p的靶基因为SMAD4，且在体外培养的PCO模型中，上调miR-204-5p的表达可抑制EMT的形成及其相关基因的表达，从而促成了本发明。
[0017]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0018]实施例1:has-miR-204-5p的筛选及靶基因SMAD4的确定
[0019]1、样品RNA提取与检测
[0020]生物材料来源:正常人和后发性白内障患者晶体囊膜
[0021]根据TRIzol (Invitrogen) and miRNeasy mini kit (QIAGEN)说明书，提取 miRNA在内的总RNA。
[0022]I)收集晶体囊膜加入ImL TRIzol (IOuL^-巯基乙醇)试剂，裂解后室温放
[0023]置5min。
[0024]2)加入200 ii L氯仿，剧烈震荡15s后室温静置2_3min，12，000Xg4°C离心15min。
[0025]3)去上清，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀。
[0026]4)将步骤3中得到的溶液和沉淀转移到2mL RNeasy Mini spin column中，轻轻盖上管盖，≥ 8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0027]5)向吸附柱中加入700uL Buffer RWT，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0028]6)向吸附柱中加入500uL Buffer RPE，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0029]7)重复 6。
[0030]8)将吸附柱放入一个新的RNeasy Mini spin column中，≥8000xg室温离心Imin,室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液
[0031]9)将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入20uL RNase-free ddH20,轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心lmin，得到RNA溶液。
[0032]使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以此计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变形凝胶琼脂糖电泳，检测RNA纯度和完整性。
[0033]2、制备荧光标记探针
[0034]米用miRCURYTMHy3?/Hy5TMPower 标记试剂盒(Exiqon, Vedbaek, Denmark),用 T4RNA连接酶将Hy3?基团标记miRNA3’末端。反应体系如下:
[0035]CIP reaction:
[0036]
【权利要求】
1.一种miRNA，其特征在于，所述的miRNA为has-miR-204_5p，其RNA序列为SEQ IDNO:1。
2.has-miR-204-5p或其模拟物的应用，其特征在于，所述的应用是调节Smad基因的表达。
3.权利要求2所述的has-miR-204-5p或其模拟物的应用，其特征在于，所述的应用是用于制备用于治疗后发性白内障PCO的制品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的制品为药物。
5.一种用于治疗后发性白内障的药物，其特征在于，所述的药物包含有药理有效剂量的has-m iR-204-5p和/或其模拟物。
【文档编号】A61K48/00GK103773764SQ201310730782
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】黄钰森, 王晔, 赵晓雯 申请人:山东省眼科研究所