2的凝血酶敏感性显示于图IOF中，指示在测试的凝血酶的 最大浓度（2. 5 U/mL)下，仅在测试的最高抗体水平下检测到TGA应答中的小增加。通过增 加用于起始TGA的TF浓度来增加 FXa (和凝血酶）仅轻微进一步增加 TPP-2652的TGA应 答（图10F)。这与当凝血酶预处理的TPP-2654进一步暴露于用5 pM TF生成的FXa时，应 用TPP-2654的凝血酶应答中的大增加形成对比（比较图IOE与图10G)。
[0122] 这些结果提出不同的蛋白酶敏感位点可以影响前体药物TFPI抗体至活性TFPI Ab的转换。
[0123] 实施例9 -用于抗TFPI前体药物抗体的FXa测定 材料与方法 下述试剂用于FXa测定： 测定缓冲液缓冲液是 25 mM H印es 7.4、100 mM NaCl、5 mM CaCl2、0. 1% BSA。
[0124] TFPI - R&D (目录# 2974-PI，Mff ~35 kDa)。根据产品插页说明书，通过添加 10 μL 25 mM Tris 和 150 mM NaCl，pH 7. 5,将 TFPI 重构至 100 Pg/mL (2.86 μΜ)。将 2. 86 μΜ原液1/143稀释，以生成20ηΜ工作原液。
[0125] FXa - Haematologic Technologies (目录 # HCX-0060,Mff - 58. 9 kDa)原液 2 μΜ等分试样先前在测定缓冲液中制备，并且贮存于-80°c下。2 μΜ原液1/1000稀释用于2 ηΜ工作原液。
[0126] S-2765 - Chromogenix (Cat # S-2765，Mff - 714.6 Da)通过将 25 mg 冻干材 料溶解于7 mL蒸馏水中，生成5 mM工作原液。将5 mM工作原液直接加入测定孔内。
[0127] 在测定缓冲液中生成抗TFPI抗体的4X剂量曲线。将60 PL每种抗体浓度与4X (20 ηΜ)浓度的TFPI组合。将抗体/TFPI混合物在室温下温育30分钟。将120 μL 2Χ (2 ηΜ)浓度的FXa加入Ab/TFPI混合物中，并且在室温下温育30分钟。随后将Ab/TFPI/FXa混 合物以100 ML/孔一式两份转移至测定板，随后为20 PL 5 mM底物。板立即在Molecular Devices SpectraMax板阅读器中在405 nm处动态读数3分钟。当测试白蛋白结合抗TFPI 前体药物抗体56E4-gA200时，将34 μL 8X抗TFPI抗体与34 PL不同浓度的白蛋白在96孔 圆底聚丙烯板中组合。随后将溶液在室温下温育15分钟，并且将68 PL 20 ηΜ (4Χ) TFPI 加入a -TFPI Ab/白蛋白中。
[0128] 如图11中所示，gA200的Vniax不受人或猴白蛋白影响。白蛋白结合前体药物抗体 56E4-gA200随着白蛋白浓度增加而减少乂_。当人或猴白蛋白的浓度达到5 μΜ时，前体药 物抗体的抗TFPI活性90%被抑制。
[0129] 实施例10 -抗TFPI前体药物抗体的蛋白酶消化 Novagen凝血酶切割捕获试剂盒（69022-3 )和Novagen因子Xa试剂盒（69037-3 )用于 前体药物的蛋白酶切割和蛋白酶耗尽。
[0130] 如下文简要描述的，生物素化的凝血酶用于前体药物切割。
[0131] 关于每种前体药物的50 PL反应含有5 Pg前体药物、5 PL IOx试剂盒凝血酶切割 /捕获缓冲液、1单位凝血酶、去离子水至50 μL。反应在37°C下温育1小时。在切割反应 后，使用16 ml沉降树脂（32 ml的50%浆)/酶单位的比，用链霉抗生物素蛋白琼脂糖(在试 剂盒中供应）去除生物素化的凝血酶。在琼脂糖加入反应管中之后，使管在室温下温育30 分钟，伴随轻轻振荡。将整个反应转移至具有旋转过滤器的试剂盒供应的样品杯。随后将 管以500 X g离心5分钟。收集管中的滤液含有切割的前体药物，不含生物素化的凝血酶。
[0132] 当因子Xa用于前体药物切割时，关于每种前体药物的50 PL反应含有5 Pg前体 药物、5 PL IOx试剂盒因子Xa切割/捕获缓冲液、1单位因子Xa和去离子水至50 PL总体 积。反应在37°C下温育1小时。在切割反应后，用Xarrest ? Agarose (试剂盒中供应的） 去除因子Xa。Xarrest Agarose首先通过添加11体积的Ix因子Xa切割/捕获缓冲液/ 沉积树脂体积的Xarrest Agarose进行平衡。将Xarrest琼脂糖以1000 X g离心5分钟。 将上清液取出且弃去。将琼脂糖重悬浮于10体积的IX因子Xa切割/捕获缓冲液中，并且 以1000 X g离心5分钟。将上清液取出且弃去。将一沉积树脂体积的IX因子Xa切割/捕 获缓冲液加入管中，并且将树脂完全重悬浮。将制备的Xarrest Agarose转移至2 ml旋转 过滤器（由试剂盒包括的）的样品杯。将前体药物切割反应的整个体积加入制备的Xarrest Agarose。使管在室温下温育5分钟，并且以1000 X g离心5分钟，以去除Xarrest Agarose。 结合的因子Xa保留在样品杯中，并且在离心过程中将切割的前体药物流动到滤液管内。
[0133] 实施例11 -抗TFPI前体药物抗体的LC-MS 抗TFPI前体药物抗体TPP-2652和TPP-2654的LC-MS分析在完整或还原条件下进行。 对于完整蛋白质，直接将2 Pg装载至PLRP柱。对于还原样品，在装载至PLRP柱之前，测试 样品已用10 mM DTT、37°C处理30分钟。
[0134] 使用 Agilent 1200 Capillary LC System与PLRP-S(8 Pm 4000A，0. 3 X 150mm)， 在70°C下进行LC分离。用于LC的缓冲液系统是：A :水，具有0. 1%甲酸+0. 01% TFA，B :乙 腈，具有〇. 1%甲酸+0.01% TFA，流速10 μL7分钟。梯度：10% B 2分钟，至90% B 15分钟， 90% B共5分钟，10% B平衡共10分钟。
[0135] 使用Agilent 6520 Q-TOF系统执行MS分析。条件是DualEsi来源，气温：350°C， 干燥气体：7 psi，喷雾器：10psi，扫描范围：500-3000 amu，l个光谱/s。两个实验/循环： 3500v，175v粉碎器，65v撇渣器用于还原形式，以及4000v，350v粉碎器，IOOv撇渣器用于完 整蛋白质。参考离子：1221. 990637和2421. 91399 amu，50 ppm窗，Min 1000。将前体药物 抗体纯化且通过蛋白酶凝血酶或因子Xa消化。在这些蛋白酶去除后，使用LC-MS分析抗体。 结果指示蛋白酶切割白蛋白结合肽。TPP-2652和TPP-2654的代表性数据显示于图16A-C。
[0136] 表2 -关于图13的关键。
[0137] 根据本公开内容，本文公开且请求保护的所有组合物和方法均可无需过度实验而 制备且执行。虽然本公开内容的组合物和方法已按照优选实施方案进行描述，但对于本领 域技术人员显而易见的是：可以对组合物和方法，以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺 序中应用变动，而不背离公开内容的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见的是生物学 和生理学两者相关的某些试剂可以取代本文描述的试剂，同时仍实现相同或相似结果。对 于本领域技术人员显而易见的是：所有此类相似取代物或修饰视为在如通过所附权利要求 限定的本发明的精神、范围和概念内。
【主权项】
1. 一种抗体，其包含： (a) 含有第一轻链可变区和第一重链可变区的第一可变结构域，所述第一可变结构域 与组织因子途径抑制剂（TFPI)结合； (b) 与所述第一轻链可变区和/或第一重链可变区的氨基末端连接的掩蔽结构域；和 (c) 介于所述第一轻链可变区和/或第一重链可变区和所述掩蔽结构域之间的蛋白酶 可切割接头。2. 权利要求1的抗体，其中所述蛋白酶可切割结构域是凝血酶、纤溶酶、因子Vila或因 子Xa切割位点。3. 权利要求1的抗体，其中所述掩蔽结构域包含第二可变结构域，其包含第二轻链可 变区和第二重链可变区。4. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAUIgA2、分泌 型IgA、IgD和IgE抗体。5. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是人或人源化抗体。6. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是单链抗体。7. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每 个第一轻链可变区的氨基末端。8. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每 个第一重链可变区的氨基末端。9. 权利要求1的抗体，其中所述抗体是二价的且包含四个掩蔽结构域，一个连接至每 个第一轻链可变区和每个第一重链可变区的氨基末端。10. 权利要求9的抗体，其中所述掩蔽结构域中的两个是第二轻链可变区，并且所述掩 蔽结构域中的两个是第二重链可变区，其中所述第二轻链可变区和第二重链可变区形成第 二可变结构域。11. 权利要求3或10的抗体，其中所述第二可变结构域与组织因子（TF)、红细胞或白 蛋白结合。12. 权利要求1、7或8的抗体，其中所述掩蔽结构域是白蛋白结合肽或蛋白。13. -种表达载体，其包含处于启动子的控制下的根据权利要求1-12的抗体的编码 区。14. 一种细胞，其包含根据权利要求13的表达载体。15. -种药物制剂，其包含用药学可接受的缓冲液、载体或稀释剂配制的根据权利要求 1-12的抗体。16. -种治疗对象中的凝血障碍的方法，其包括以有效促进所述对象中的凝血的量给 所述对象施用包含下述的抗体： (a) 含有第一轻链可变区和第一重链可变区的第一可变结构域，所述第一可变结构域 与组织因子途径抑制剂（TFPI)免疫学结合； (b) 与所述第一轻链可变区和/或第一重链可变区的氨基末端连接的掩蔽结构域；和 (c) 介于所述第一轻链可变区和/或第一重链可变区和所述掩蔽结构域之间的蛋白酶 可切割接头。17. 权利要求16的方法，其中所述蛋白酶可切割结构域是凝血酶、纤溶酶、因子Vila或 因子Xa切割位点。18. 权利要求16的方法，其中所述掩蔽结构域包含第二可变结构域，其包含第二轻链 可变区和第二重链可变区。19. 权利要求16的方法，其中所述对象是人。20. 权利要求16的方法，其中所述对象是非人哺乳动物。21. 权利要求16的方法，其中所述抗体是单链抗体。22. 权利要求16的方法，其中所述抗体是二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至 每个第一轻链可变区的氨基末端。23. 权利要求16的方法，其中所述抗体是二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至 每个第一重链可变区的氨基末端。24. 权利要求16的方法，其中所述抗体是二价的且包含四个掩蔽结构域，一个连接至 每个第一轻链可变区和每个第一重链可变区的氨基末端。25. 权利要求24的方法，其中所述掩蔽结构域中的两个是第二轻链可变区，并且所述 掩蔽结构域中的两个是第二重链可变区，其中所述第二轻链可变区和第二重链可变区形成 第二可变结构域。26. 权利要求18或25的方法，其中所述第二可变结构域与组织因子（TF)、红细胞或白 蛋白结合。27. 权利要求16、22或23的方法，其中所述掩蔽结构域是白蛋白结合蛋白。28. 权利要求16的方法，其中所述对象患有创伤、血友病或癌症。29. 权利要求16的方法，其中所述对象患有血友病A或B。30. 权利要求16的方法，其中所述抗体全身施用。31. 权利要求16的方法，其中所述抗体局部或区域性施用于出血部位。32. 权利要求16的方法，其中所述抗体皮下、静脉内或动脉内施用。33. 权利要求16的抗体，其中所述抗体是IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAUIgA2、分 泌型IgA、IgD和IgE抗体。34. 权利要求16的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。35.权利要求16的方法，其中所述抗体与人组织因子途径抑制剂的Kunitz结构域2结 合。
【专利摘要】本公开内容提供了仅在暴露于来源凝血级联的蛋白酶后，与组织因子途径抑制剂（TFPI）特异性结合的前体药物抗体。所述前体药物抗体可用于治疗出血障碍例如血友病。当在此类治疗中使用时，这些前体药物抗体显示相对于其他抗TFPI抗体增加的半衰期，同时减轻副作用例如血栓形成的可能性。
【IPC分类】C07K16/36
【公开号】CN105209496
【申请号】CN201480027867
【发明人】Z.王, J.默菲, T.赫米斯顿, Y.朱, R.温特
【申请人】拜尔健康护理有限责任公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2906095A1, EP2970498A1, US20160009817, WO2014144689A1