Biacore数据)。
[0034] 图15Β.在人/猴白蛋白的不存在或存在下，在用或不用凝血酶或FXa处理后，白 蛋白结合抗TFPI前体药物的TFPI结合(表面等离子体共振)。
[0035] 图16A-C.(图16Α-Β)在凝血酶切割后，抗TFPI前体药物TPP-2652和ΤΡΡ-2654 的质谱。（图16C)用FXa切割的抗TFPI前体药物ΤΡΡ-2654的质谱。
[0036] 公开内容的详述 本公开内容描述了安全和长效的针对组织因子途径抑制剂（TFPI)的抗体，用于血友病 及其他疗法。目前，抗TFPI抗体分别处于临床前和临床开发中，但抗TFPI抗体的体内半 衰期相对短于其他IgG抗体的那种。这可能是由于靶介导的清除。另外，在具有炎症或用 FVIIa治疗的患者中，也已引发抗TFPI抗体可能引起副作用的担心。
[0037] 为了解决这些问题，本公开内容中描述的抗TFPI前体药物抗体已得到开发。在它 们暴露于由凝血级联生成的蛋白酶之前，这些抗体具有显著降低的与TFPI的结合。一旦 凝血起始且蛋白酶生成，蛋白酶就通过切割掩蔽结构域来活化抗TFPI抗体，因此增加其对 TFPI的结合。这些前体药物抗体可以用于治疗出血障碍例如血友病，同时与先前描述的抗 TFPI抗体相比较，提供更佳的安全和药物代谢动力学概况。
[0038] 1.抗TFPI前体药物抗体 本文公开的抗体与TFPI特异性结合；即它们与TFPI结合的亲和力比其对于无关抗原 (例如BSA、酪蛋白）的结合亲和力更高(例如至少两倍高)。如本文使用的，术语"组织因子 途径抑制剂"或"TFPI"指由细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同种型和物种同系物。
[0039] 在一些实施方案中，前体药物抗体以至少约IO5 M1至约IO12 M1 (例如IO5 M \ IO5.5 M1UO6 M1UO6.5 M1UO7 M1UO7.5 M1UO8 M1UO8.5 M1UO9 M1UO9.5 M1UO10 Μ1、 ΙΟ10·5 M1UO11 M 1UO11'5 M1UO12 M 3的亲和力与TFPI结合。抗体与抗原结合的亲和力 (Kd)可以使用本领域已知的任何方法进行测定，包括例如免疫测定例如酶联免疫特异性测 定（ELISA)、生物分子相互作用分析（BIA)(例如 Sjolander & Urbaniczky CAeva 63:2338-2345,1991 ;Szabo 等人，Ω/rr. 5:699-705,1995，这两 者均引入本文作为参考)、和用于定量与表达抗原的细胞结合的抗体的荧光激活细胞分选 (FACS) AIA是用于实时分析生物特异性相互作用的技术，而无需标记相互作用物中的任一 种(例如BIAC0RE?)。光学现象表面等离子体共振（SPR)中的变化可以用作生物分子之间的 实时反应的指示。
[0040] 可以使用基本上全长的免疫球蛋白分子(例如IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、 IgM、IgD、IgE、IgA)，其抗原结合片段例如Fab或F (ab' ) 2，或者含有能够与TFPI特异性 结合的抗原结合位点的构建体例如scFv、Fv或双抗体，来构建抗TFPI前体药物抗体。术语 "抗体"还包括能够将抗体互补性决定区（CDR)插入片段定向到与天然抗体中发现的那种相 同的活性结合构象的其他蛋白质支架中，使得相对于CDR由其衍生的天然抗体的TFPI结合 活性，用这些嵌合蛋白观察到的与TFPI的结合得到维持。
[0041] 如本文使用的，术语"经分离的抗体"是基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗 体的抗体(例如与TFPI结合的经分离的抗体基本上不含结合除TFPI外的抗原的抗体)。然 而，与人TFPI的表位、同种型或变体结合的经分离的抗体可以与例如来自其他物种的其他 相关抗原(例如TFPI物种同系物）具有交叉反应性。经分离的抗体可以基本上不含其他细 胞材料和/或化学品。
[0042] 特定的抗TFPI抗体公开于美国专利公开US 2012/20268917、US2012/0108796、 US2011/0229476以及国际专利公开W02012/135671中，这些文件各自的完整公开内容引入 本文作为参考。
[0043] A.掩蔽抗体 在一些实施方案中，本文公开的前体药物抗体被改造为具有掩蔽结构域，其降低抗体 与TFPI结合的能力。这些掩蔽结构域可以识别凝血级联的元件或其他相关标记物。在一些 实施方案中，掩蔽结构域包括下述元件，其识别生物分子例如组织因子（TF)、红细胞（RBC) 和/或白蛋白。这些掩蔽结构域通过蛋白酶切割位点附着至抗体的可变区，如图1中所示。 这些掩蔽结构域可以是抗体、肽、蛋白质或另一种支架。无论如何，掩蔽结构域通过其可变 区阻止抗体与TFPI的结合，直至被去除。
[0044] 本文公开的前体药物抗体被改造为包含由一种或多种蛋白酶识别的蛋白酶切割 位点，其切割释放掩蔽结构域且允许抗体与TFPI结合。如本文使用的，"蛋白酶切割位点" 指由蛋白酶识别且切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点定位于掩蔽抗 TFPI抗体的可变区，且如图1中所示。在一些实施方案中，抗TFPI前体药物抗体包括一个 或多个蛋白酶切割位点，其可以被凝血酶、纤溶酶和/或因子Xa切割。还设想可以使用关 于通过凝血级联活化或上调的蛋白酶的其他蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，掩蔽抗 TFPI前体药物抗体的可变区的氨基酸序列包含除蛋白酶切割位点之外的多肽接头(如例如 图1中举例说明的)，和/或与TF、RBC或白蛋白结合的抗体、肽、蛋白质或另一种支架。接头 可以是单个氨基酸或多肽序列(例如最高达100个氨基酸)。例如，接头可以是GGGGS (SEQ ID NO: 149)。其他有用的接头包括SEQ ID NO: 151-176中所示的那些。在其他实施方案 中，不存在接头，并且切割位点自身以这样的方式插入可变区上，以便掩蔽其与TFPI的结 合，如图1中所示，伴随与TF、RBC或白蛋白结合的抗体、肽、蛋白质或另一种支架。
[0045] 关于凝血酶的至少两个最佳切割位点已得到测定=(I)X1-X2-P-R-X 3-X4 (SEQ ID NO: 147)，其中XjP X 2是疏水性氨基酸，而X 3和X 4是非酸性氨基酸；和（2)GRG。凝血酶在 精氨酸残基后特异性切割。纤溶酶还可以切割两个前述切割位点，然而与凝血酶相比较具 有更少的特异性。其他有用的凝血酶切割位点作为SEQ ID NO: 1-60提供。其他有用的纤 溶酶切割位点作为SEQ ID NO: 12、47、48、53和61-130提供。在一些实施方案中，切割位 点是 LVPRGS (SEQ ID NO: 137)。
[0046] 在一些实施方案中，使用因子Xa切割位点例如I- (E或D)-G-R (SEQ ID NO: 148)。其他有用的因子Xa切割位点作为SEQ ID NO: 29、59和61-69提供。
[0047] 除切割位点之外，第二蛋白酶切割位点，所谓的外部位点，可以引入抗TFPI前体 药物内，以使得切割更有效。凝血酶的外部位点可以来自蛋白酶底物或抑制剂，例如PAR1、 纤维蛋白原和水蛭素的天然外部位点。外部位点还可以是来自蛋白质的其他外部位点的衍 生物。
[0048] B.抗体合成 抗TFPI前体药物抗体可以合成或重组产生。许多技术可用于产生抗体。例如，噬菌 体抗体技术可以用于生成抗体（Knappik等人，Sio丄忽&57-86,2000,其引入本 文作为参考)。用于获得抗体的另一种方法是筛选来自B细胞的DNA文库，如WO 91/17271 和TO 92/01047中所述，所述两个申请均引入本文作为参考。在这些方法中，产生了其中 成员在其外表面上展示不同抗体的噬菌体文库。抗体通常作为Fv或Fab片段展示。展示 抗体的噬菌体通过与所选蛋白质的结合的亲和力富集进行选择。抗体还可以使用三源杂 交瘤（trioma)方法进行生产(例如Oestberg等人，办Ariofcwa之:361-367,1983 ;美国专利 4, 634, 664 ;美国专利4, 634, 666,所有所述参考文献均引入本文作为参考)。
[0049] 抗体还可以由表达抗体的任何细胞进行纯化，所述细胞包括已用编码抗体的表达 构建体进行转染的宿主细胞。宿主细胞可以在由其表达抗体的条件下进行培养。使用本领 域众所周知的方法，纯化的抗体可以与其他细胞组分分开，所述其他细胞组分可以在细胞 中与抗体结合，例如某些蛋白质、碳水化合物或脂质。此类方法包括但不限于尺寸排阻层 析、硫酸铵分级、离子交换层析、亲和层析和制备型凝胶电泳。可以通过本领域已知的任何 方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，来评价制剂的纯度。纯化抗体的制剂可以含有超过 一类抗体。
[0050] 可替代地，可以使用化学方法来合成其氨基酸序列，例如通过使用固相技术 的直接肽合成，来生产抗TFPI前体药物抗体(例如Merrifield，J.办?. CAe?. 5bc. 滞:2149-2154，1963;1?(*6找6等人，5^￡?/^￡?之你:202-204，1995，所述两个参考文献均引 入本文作为参考)。蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化来执行。任选地，抗体的片 段可以使用化学方法分开合成且组合，以产生全长分子。
[0051] 在一些实施方案中，抗TFPI前体药物抗体还可以以"单链Fv (scFv)形式"进行 构建，其中蛋白酶切割位点以这样的方式插入肽接头、抗体、肽、蛋白质或可变区上的另一 种支架上或周围，以便掩蔽其识别TFPI的能力。因为肽接头是使scFv的两个可变区保持 在一起用于抗原结合所必需的，所以肽接头或侧翼区的切割允许目的蛋白酶使scFv失活 或下调scFv与其抗原的结合。
[0052] 在一些实施方案中，抗TFPI前体药物抗体以" IgG形式"构建，具有两个结合位点， 并且可以以这样的方式包含在可变区和抗体、肽、蛋白质或另一种支架之间的一个、两个、 三个或四个蛋白酶切割位点，以便掩蔽其识别TFPI的能力。在每种情况下，蛋白酶切割位 点可以在一侧或两侧上侧面为接头。进一步地，在每种情况下，切割位点可以是相同或不同 的。
[0053] 2.多核苷酸 本公开内容还提供了编码前体药物抗体的多核苷酸。这些多核苷酸可以例如用于产生 大量抗体用于治疗用途。
[0054] 抗体编码cDNA分子可以用标准分子生物学技术进行制备，使用mRNA作为模板。 其后，使用本领域已知并且在手册例如Sambrook等人（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Cold Spring Harbor, N. Y. ; 1989)第1-3卷，其引入本文作为参考）中公开的分子生物学技术，可以复制cDNA分 子。扩增技术例如PCR可以用于获得另外的多核苷酸拷贝。可替代地，合成化学技术可以 用于合成编码抗TFPI前体药物抗体的多核苷酸。
[0055] 为了表达编码抗体的多核苷酸，多核苷酸可以插入表达载体内，所述表达载体含 有所插入的编码序列转录和翻译的必需元件。本领域技术人员众所周知的方法可以用于 构建表达载体，其含有编码抗体的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括 体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。此类技术例如在Sambrook等人（1989)和 Ausubel等人（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,New York, N. Y.，1995)中得到描述，所述两个参考文献均引入本文作为参考。
[0056] 各种表达载体/宿主系统可以用于含有且表达编码抗体的序列。这些包括但不限 于微生物例如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体 转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如 花椰菜花叶病毒，CaMV ;烟草花叶病毒，TMV)转化的植物细胞系统；或细菌表达载体(例如 Ti或pBR322质粒)，或动物细胞系统。
[0057] 控制元件或调节序列是载体的那些非翻译区一增强子、启动子、5'和3'非翻译 区一其与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译。此类元件可以在强度和特异性方面 不同。取决于载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱 导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子。杆状病毒多角体蛋白 启动子可以用于昆虫细胞中。衍生自植物细胞的基因组(例如热休克、RUBISC0和储藏蛋白 基因）或植物病毒(例如病毒启动子或前导序列）的启动子或增强子可以克隆到载体内。在 哺乳动物细胞系统中，可以使用来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要生 成含有编码抗体的多核苷酸序列的多个拷贝的细胞系，则基于SV40或EBV的载体可以与适 当的可选标记物一起使用。