一种榛仁ace抑制肽及其制备方法
【专利摘要】一种榛仁ACE抑制肽及其制备方法，属于ACE抑制肽技术领域。榛仁ACE抑制肽为TLVGR(Thr?Leu?Val?Gly?Arg)和AVKVL(Ala?Val?Lys?Val?Leu)。是以长白山榛仁为原料，采用酶控制水解技术制备ACE抑制肽并通过离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析等技术分离纯化，经此方法得到的多肽活性及纯度较高，杂质较少。在最优的酶解及分离纯化条件下，得到的两种ACE抑制肽TLVGR的IC50值为0.2493mg/mL，AVKVL的IC50值为0.07306mg/mL。
【专利说明】
一种榛仁ACE抑制肽及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于ACE抑制肽技术领域，具体涉及一种榛仁ACE抑制肽及其制备方法。【背景技术】
[0002]目前，高血压患者的主要治疗药为能够抑制ACE活性的赖诺普利和卡托普利等化学合成类药物，虽然能够暂时缓解高血压症状，但却有许多毒副作用，如皮疹、高血钾、肾脏硬化、白细胞减少等，因此开发和使用天然来源降血压药物则显得尤为重要。研究发现天然植物蛋白质经体外酶解后，能够产生具有特殊生理功能的活性肽，如促进免疫、激素调节、 抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是极具发展前景的功能因子。除此之外，现代营养学研究发现:人类摄食的蛋白质经消化道酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，多肽比游离氨基酸的生物效价和营养价值更高。其中ACE抑制肽在体外对血管紧张素转化酶-1(ACE)有抑制作用，体内试验发现对血压正常者无降压作用，只对高血压患者起到降压作用，是一种无任何毒副作用并极具市场开发潜力的降血压药物。
[0003]长白山榛子中蛋白质含量大概占15-30%，各类氨基酸含量比较均衡，且包含多种人体必需氨基酸，是一种优质的植物蛋白资源，但目前对榛子的研究和利用主要集中在油脂的提取和加工方面，对蛋白资源利用极少，尤其是油脂加工副产物脱脂柏中蛋白含量高达40%以上，以其为原料进行各种活性肽的开发，将对长白山榛子资源的综合利用具有极大的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种榛仁ACE抑制肽的制备方法，以长白山榛仁为原料， 采用酶控制水解技术制备ACE抑制肽并通过离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析等技术分离纯化，经此方法得到的多肽活性及纯度较高，杂质较少。
[0005]本发明的目的之二是对榛仁ACE抑制肽进行结构鉴定，采用高效液相色谱-电喷雾飞行时间串联质谱(HPLC-ES1-TOF MS/MS)技术并经从头测序(de novo)方法进行质谱解析，鉴定出 2 种新的榛仁 ACE 抑制肽 TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和 AVKVL(Ala-Val-Lys-Val-Leu)，旨在为降血压药物的合成和榛仁ACE抑制肽构效关系研究提供理论基础。
[0006]—种榛仁ACE抑制肽的制备方法，所述ACE抑制肽包括两条肽，分别为五肽TLVGR和 AVKVL，其步骤如下:
[0007](l)ACE抑制肽的制备[〇〇〇8] 取2?5g榛仁分离蛋白(碱溶酸沉法制备，参考《Funct1nal Properties of the Protein Isolate and Major Fract1ns of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China》，Dan Wu，Wei_hong Min)，加lOOmL蒸馈水揽摔，90?10CTC 水浴10?20min使蛋白变性，冷却至室温，用0.6mol/L NaOH调pH值7?10,然后加入 Alcalase 2.4L(碱性蛋白酶一种)，加酶量4000?8000U/g分离蛋白，在40?70°C下水解2? 5h，保持pH值不变，反应结束后迅速于90°C下加热10?20min灭酶，然后冷却至室温，用HC1调节pH值至中性后5000?8000r/min离心10?20min，上清液冷冻干燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；
[0009] (2)ACE抑制肽的分离纯化
[0010]将冷冻干燥后的粗榛仁ACE抑制肽，加入蒸馏水配成溶液，过0.22WI1滤膜后，进行离子交换层析，缓冲溶液A为15?25mmol/L Tris-HCl，缓冲溶液B为0.5?2mol/L NaCl，使用紫外检测仪在280nm波长下检测，收集4种组分，真空冷冻干燥，测定ACE抑制率;然后将离子交换层析得到的抑制率最高组分进行凝胶过滤层析，多肽中的组分按分子量大小依次分离，收集2种组分，真空冷冻干燥，测定ACE抑制率;将抑制率最高组分富集进行反相高效液相层析，收集6种组分，真空冷冻干燥，测定ACE抑制率，ACE抑制率最高的多肽组分即本发明所述的榛仁 ACE 抑制肽，同时包括 TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和 AVKVL(Ala-Val-Lys-Val-Leu)〇
[0011] (3)ACE抑制肽的结构鉴定[0〇12]采用ES1-TOF MS/MS鉴定ACE抑制肽的氨基酸序列，运用de novo方法进行质谱数据解析。[0〇13]步骤⑵中所述的离子交换层析采用阴离子交换柱，上样浓度1?l〇mg/mL(粗榛仁 ACE抑制肽加蒸馏水配制成的溶液浓度)，上样体积5?20mL，平衡流速1?5mL/min，0 %? 100 % B线性洗脱，洗脱流速0.1?5mL/min。
[0014]步骤(2)中所述的凝胶过滤层析采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱，洗脱液为纯水，上样浓度10?50mg/mL，上样量1?10mL，洗脱流速0.1?5mL/min。
[0015]步骤(2)中所述的反相高效液相层析采用C18色谱柱，流动相A为含有质量分数 0.1%1?4的乙腈，8为含有质量分数0.1%1?4的水，上样浓度10?5011^/1^，进样体积10?80 yL，100 ?60%B 线性洗脱 30 ?60min;流速0.1 ?lmL/min。
[0016]本发明相比现有技术的有益效果为:
[0017]本发明首次公开了一种榛仁ACE抑制肽的制备方法，采用Alcalase酶解榛仁分离蛋白进行制备并纯化鉴定出两条ACE抑制肽，Alcalase是一种丝氨酸蛋白酶，属非特异性内切酶，主要作用于含有酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的肽键，酶切位点主要位于多肽链的内部与末端肽键。故采用Alcalase水解度高，能够得到肽链较短的小肽，研究发现小肽ACE抑制作用更强，且更有利人体小肠的吸收，无毒副作用、性质温和、具有较好的降血压功能。本发明公布的分离纯化方法可以将不同带电性、不同分子量、不同极性的多肽分开，凝胶层析分离可以将离子交换层析中引入的盐除去，分离路线设计合理。在质谱解析中，针对NCBI中已鉴定的植物蛋白数量较少的情况，采用常规的Uniprot全序列数据库搜索与分析并不适用，因此采用de novo法确定组分的序列结构可以防止活性组分的遗漏。在最优的酶解及分离纯化条件下，得到的两种ACE抑制肽TLVGR的IC5Q值为0.2493mg/mL，AVKVL的IC5Q值为 0.07306mg/mL。这个指标体现的是制备的肽在体外抑制ACE活性的强弱(能够使ACE活性降低一半时所需的肽含量)，此数值越低，表明ACE抑制活性越高。【附图说明】[〇〇18]图1为离子交换层析分离图；
[0019]图2为凝胶过滤层析分离图；
[0020]图3为反相高效液相层析分离图；
[0021]图4为ACE抑制肽TLVGR的质谱图；[〇〇22]图5为ACE抑制肽AVKVL的质谱图；[〇〇23]图6为ACE抑制肽的稳定性(A:温度;B:pH; C:金属离子;D:盐浓度;E:肠道消化酶)。 【具体实施方式】
[0024]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。
[0025](l)ACE抑制肽的制备
[0026]取3g榛子分离蛋白(碱溶酸沉法制备，参考《Funct1nal Properties of the Protein Isolate and Major Fract1ns of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China》，Dan Wu，Wei_hong Min)，加lOOmL蒸馈水揽摔，9CTC水浴 15min使蛋白变性，冷却至室温，用0.6mol/L NaOH调pH值至8.3，加入Alcalase2.4L(加酶量 5517.34U/g底物)，55 °C水解4.3h，保持pH值不变，反应结束后迅速90 °C加热15min灭酶，然后冷却至室温，用HC1调节pH值至中性后5000r/min离心10min，上清液冷冻干燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；[〇〇27](2)ACE抑制肽的离子交换层析[〇〇28]将冷冻干燥后的粗榛仁ACE抑制肽，加入蒸馏水配成lmg/mL溶液，过0.22wii滤膜后，用AKTA蛋白纯化系统进行分离(离子交换层析)，采用HiTrap Q HP(1.6CmX2.5Cm)预装柱，上样量l〇mL，缓冲溶液A为20mmol/L Tris-HCl，缓冲溶液B为lmol/L NaCl，平衡流速 5mL/min，0 % -50 % B线性洗脱，洗脱流速0.5mL/min，紫外检测仪在280nm波长下检测，图1为按此条件分离得到的离子交换层析分离图谱，收集4种组分，冷冻干燥，测定ACE抑制率(四种组分抑制率分别是53.7%，28.3%，51.0%，24.9% )，将活性最高组分富集以备下一步分离。
[0029](3)ACE抑制肽的Sephadex G-15凝胶层析
[0030]将离子交换层析得到的活性最高组分进行凝胶过滤分离，采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱(1.〇cm X 50cm)，洗脱液为纯水，上样浓度30mg/mL，上样量3mL，洗脱流速0.5mL/ min，于280nm波长下紫外检测光吸收值。图2为按此条件得到的凝胶过滤层析分离图谱，将分离得到的2种组分收集，真空冷冻干燥，测定ACE抑制率(抑制率分别是76.3 %及65.7 % )， 将活性最高组分富集以备下一步分离。[〇〇31](4)ACE抑制肽的反相高效液相层析
[0032]将凝胶层析分离得到的活性最高组分溶解于去离子水中，调节其浓度为10mg/mL。 应用Agilent 1200高效液相色谱系统进行分离。分离条件为:色谱柱Diamonsil C18(250X 4.6mm);流动相A为含有0.1 % (质量分数)TFA的乙腈，B为含有0.1 % (质量分数)TFA的水;90 ?70%B线性洗脱30min;进样体积80此，流速0.5mL/min，检测波长215nm;图3为按此条件得到的反相高效液相层析分离图谱，将收集的6种组分冷冻干燥。配成同浓度溶液，测定各组分ACE抑制率(抑制率分别是56.3%，86.9%，41.3%，58.0% ,34.6% ,45.8%)，将活性最高组分富集以备结构鉴定。[〇〇33](5)ACE抑制肽结构鉴定[〇〇34]采用Agilent 1200型快速分离液相色谱系统和Agilent 6520 Q-T0F质谱仪。液相条件:色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(2.1X 150mm，3.5iim);二元线性梯度洗脱:流动相:(A)0.1 % (质量分数)甲酸水溶液；(B)乙腈;流动相梯度:0?30min，5%?30;柱温35 。(:，流速0.4mL/min，进样量5此。[〇〇35]质谱条件:采用电喷雾正离子扫描模式(ESI + );质量扫描范围m/z 100?2000;干燥气流速(N2)为9L/min，干燥器温度300°C，雾化电压35psig，毛细管电压为3.5kV，碎裂电压175V，锥孔电压65V，八级杆射频电压250V，二级质谱碰撞电压12-15eV。
[0036]肽段序列解析运用Peaks 7.5软件(B1informatics Solut1ns Inc)。两种ACE抑制肽结构分别是TLVGR和AVKVL，分子量分别为544.3333和528.3635,图4和图5分别是ACE抑制肽TLVGR和AVKVL的质谱图，其对应的IC5Q值分别是0 ? 2493mg/mL，和0 ? 07306mg/mL。[〇〇37](6)ACE抑制肽的稳定性
[0038]取经过反相高效液相分离纯化得到的抑制率最高组分0.lg，加入离子水配成浓度 lmg/mL溶液，以0 ? 5mol/L HC1和0 ? 5mol/L NaOH调节pH7 ? 0，分别置于不同温度下水浴2h，测定ACE抑制活性。结果见图6A，在20-100 °C之间，ACE抑制率保持在80 %以上，说明ACE抑制肽具有耐热性。
[0039]取经过反相高效液相分离纯化得到的抑制率最高组分0.lg，加入离子水配成浓度 lmg/mL溶液，用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH，室温放置2h，测定ACE抑制活性。结果见图6B，ACE 抑制肽在酸性和碱性条件下活性均很稳定。
[0040]取经过反相高效液相分离纯化得到的抑制率最高组分0.lg，分别溶于不同浓度 NaCl溶液中，室温放置2h，测定ACE抑制活性。结果见图6C，100yg/ml Cu2+和Ca2+会使ACE抑制活性显著下降。
[0041]取经过反相高效液相分离纯化得到的抑制率最高组分0.lg，配制浓度为lmg/mL肽溶液，向溶液中加入不同金属离子Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、K+，浓度分别达至lj 100yg/mL，静置lh， 测定ACE抑制活性。结果见图6D，NaCl浓度超过0.4mol/L会造成ACE率显著下降，在ACE抑制肽贮藏及加工过程中要防止这些因素对抑制活性的影响。
[0042]取经过反相高效液相分离纯化得到的抑制率最高组分0.lg，加去离子水配成浓度 lmg/mL溶液，以lmol/L HC1调节pH到2 ? 0，按胃蛋白酶:ACE抑制肽为1:100(w/w)的比例加入胃蛋白酶，37°C下酶解4h后，100°C水浴10min灭酶;加入lmol/L NaOH调节pH至7.0,取水解液50mL，5000r/min离心15min，测定上清液ACE抑制活性。在剩余5 OmL水解液中再按1:1比例加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，37 °C水解4h，100 °C水浴10min灭酶，5000r/min离心15min， 测定上清液ACE抑制活性。结果见图6E，经过胃肠道消化酶处理后ACE抑制率仅下降15.2%， 说明其对消化酶的水解具有一定的抗性，可以作为一种口服降血压肽。[〇〇43]以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下， 2种ACE抑制肽的氨基酸序列其他排列组合方式及对多肽做出的若干改进和修饰，也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种榛仁ACE抑制肽，其特征在于:为五肽TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和AVKVL (Ala-Val-Lys-Val-Leu)〇2.权利要求1所述的榛仁ACE抑制肽的制备方法，其步骤如下:(1)ACE抑制肽的制备取2?5g榛仁分离蛋白，加lOOmL蒸馏水搅拌，90?100°C水浴10?20min使蛋白变性，冷 却至室温后调pH值7?10,然后加入Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，加酶量为4000?8000U/g分 离蛋白，在40?70°C下水解2?5h，保持pH值不变，反应结束后迅速于90°C下加热10?20min 灭酶，然后冷却至室温，调节pH值至中性后5000?8000r/min离心10?20min，上清液冷冻干 燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；(2)ACE抑制肽的分离纯化将粗榛仁ACE抑制肽加入蒸馏水配成溶液，过0.22wii滤膜后，进行离子交换层析，然后 将离子交换层析得到的抑制率最高组分进行凝胶过滤层析，再将抑制率最高组分富集进行 反相高效液相层析，所得ACE抑制率最高的多肽组分即榛仁ACE抑制肽。3.如权利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制备方法，其特征在于:步骤(1)是用0.6mol/L NaOH 调 pH值 7 ?10。4.如权利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的离子 交换层析采用阴离子交换柱，缓冲溶液A为15?25mmol/L Tris-HCl，缓冲溶液B为0.5? 2mol/L NaCl，上样浓度1?10mg/mL，上样体积5?20mL，平衡流速1?5mL/min，0%?100%B 线性洗脱，洗脱流速〇.1?5mL/min。5.如权利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的凝胶 过滤层析采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱，洗脱液为纯水，上样浓度10?50mg/mL，上样量 1?10mL，洗脱流速0? 1?5mL/min。6.如权利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的反相 高效液相层析采用C18色谱柱，流动相A为含有质量分数0.1 % TFA的乙腈，流动相B为含有质 量分数0.1%TFA的水，上样浓度10?50mg/mL，进样体积10?80yL，100?60%B线性洗脱30 ?60min;流速0? 1 ?lmL/min〇
【文档编号】C07K1/16GK106008669SQ201610517689
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】闵伟红, 刘春雷, 李鸿梅, 方丽, 王辑
【申请人】吉林农业大学