专利名称：针对hiv-1的甘露糖免疫原的制作方法
针对HIV-1的甘露糖免疫原
本申请主要涉及糖工程，具体来说，涉及糖类人类免疫缺陷病毒 (HI V)疫苗和/或免疫原性组合物以及制备上述疫苗和组合物的方法。
背景
抗糖类识別构成获得性免疫和先天性免疫主要组成部分。然而，在 疫苗设计中，仅在少数场合下具有抗表面糖类抗体的保护特性得以开 发。就人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)而论，糖基化的抗原作用特别有意 义。HIV-1表面覆盖着大的、柔性的并缺乏免疫原性的N-联糖类，形成 '展开的聚糖屏蔽，，促进体液免疫逃避(参见如X. Wei等"Antibody neutralization and escape by HIV画l", Nature, 422(6929), pp. 307-312, 2003, 其全文在此并入作为参考)。对于HIV聚糖缺乏免疫原性已提出三种主 要的解释。首先，宿主细胞合成附着于HIV的聚糖，并因此'自体，免 疫。其次，蛋白与糖类的结合通常是弱的，并因此限制了高亲和力抗糖 类抗体的潜力。最后，多种不同的糖形可附着于任何给定的N-联附着位 点上，因此产生了高度不均一的潜在抗原混合物。许多复合物、甘露寡 糖以及杂合型聚糖都出现在HIV上，甘露寡糖聚糖密集簇生在gpl20暴 露在外的结构域上。然而，在感染过程中HIV糖类抗体并不是能通常观 察到的。
HIV-1 gpl20分子广泛地N-糖基化，该糖蛋白大约一半的分子量为 共价连接的N-聚糖所赐。在糖蛋白表面上模建的gpl20内核与N-聚糖 的晶体结构鉴定出含有N-聚糖簇的gpl20分子的一个面(参见如P.D. Kwong等"Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody", Nature, 393(6686) pp.648-659, 1998,其全文在此并入作为参考)。该面已4支称为 免疫沉默面，因为迄今为止只有一种抗体(2G12)能识别已被鉴定的糖蛋 白分子的该区。HIV-1 gpl20分子的N-糖基化被认为通过阻止抗体接近 位于N-糖基化位点下的抗原蛋白表位，从而在免疫逃避中起主要作用。 在该情况下，倘若N-聚糖屏蔽在下面的gpl20分子不被抗体识别，则它 们的正确结构不大重要。因此，通过在病毒基因组突变后导入新的N-糖基化位点，就能形成gpl20聚糖屏蔽。这促进了宿主免疫性的连续逃
避。
尽管HIV糖类抗体罕见，但是存在着许多其他的其糖类部分引发强 抗体应答的病原体。实际上，人体液抗糖类反应性的显著特征是特异于 al—2联甘露寡糖的抗甘露糖抗体的广泛分布存在。然而，不象2G12, 这些抗体并不与甘露糖一_即在上下文中所提及的'自体甘露寡糖聚 糖'结合。天然抗甘露糖抗体的可能靶标是出现在许多常见酵母类脂和 蛋白质上的细胞壁甘露聚糖。用酵母甘露聚糖免疫能提供某些与gpl20 糖类的体液交叉反应性(参见如W. E. Muller等"Polyclonal antibodies to mannan from yeast also recognize the carbohydrate structure of gpl 20 of the AIDS virus: an approach to raise neutralizing antibodies to HIV-1 infection in vitro", AIDS. 1990 Feb;4(2), pp. 159- 62.,其全文在此并入作为参考和 W. E. Muller等 "Antibodies against defined carbohydrate structures of Candida albicans protect H9 cells against infection with human immunodeficiency virus-1 in vitro", J Acquir Immune Defic Syndr. 1"1;4(7) pp. 694_703，其全文在此并入作为参考)。然而，所观察到的 效价和亲和力并不足以保证用作为预防。
尽管上述罕见的抗gp120中和抗体2G12能结合HIV包膜上的特异 性糖类表位。但2G12所识别的表位是出现在gpl20外侧结构域上的非 常稀有的甘露糖残基簇(参见如C. N. Scanlan等 "The Broadly Neutralizing Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody 2G12 Recognizes a Cluster of a 1—2 mannose Residues on the Outer Face of gpl20 J. Virol. 76 (2002) 7306-7321，其全文在此并入作为参考)。2G12 结合的主要分子决定簇是附着于gpl20的Asn332和Asn392的聚糖的al -2联甘露糖末端。尽管该簇由以密集阵列排列的、高度不规则的哺乳 动物糖基化的'自体'聚糖组成，但是因此提供了2G12 '非自体'区别 的结构基础。对2G12 Fab的结构研究揭示了 Fab的两条重链通过之前未 观察到的域交换构型相互连接(参见如D. Calarese等"Antibody domain exchange is an immunological solution to carbohydrate cluster recognition", Science, vol. 300, pp. 2065-2071, 2003，其全文在此并入作为参考)。通过 该域交换的Fab形成了延伸的抗原互补位，提供了用于多价糖类高亲合 力结合的大表面。
在HIV-1动物才莫型中对2G12的一皮动转移研究表明该抗体能保护不
受病毒攻击。业已阐明了 2G12抗多种HIV-1主要分离抹的广泛特异性 的分子机制。因此，基于已知的2G12表位结构，非常希望能开发一种 能引发2G12-样抗体并能有助于抗HIV-1的消除性免疫的免疫原。然 而，这样的免疫原的设计必须克服gpl20上聚糖表位的抗原^t拟所需要 的结构约束以及HIV缺乏免疫原性的N联聚糖所固有的免疫学约束。
一种gpl20免疫原设计的方法是合成再造2G12结合的gpl20的抗 原部分(参见如H.K Lee等 "Reactivity-Based One-Pot Synthesis of Oilgomannoses: Defining Antigens Recognized by 2G12, a Broadly Neutralizing Anti-HIV-1 Antibody", Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 43(8), pp. 1000-1003, 2004,其全文在此并入作为参考；H. Li等"Design and synthesis of a template-assembled oligomannose cluster as an epitope mimic for human HIV-neutralizing antibody 2G12", Org. Biomol. Chem., 2 (4), pp. 483 - 488, 2004,其全文在此并入作为参考；L.-X. Wang, "Binding of High-mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV-1 Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34, 2004,其全文在此并入作为参考)。合成的甘露糖 苷以多价形式展示，能增加几乎100倍的它们对2G12的亲和力(参见如 L.-X. Wang, "Binding of High-mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV画l Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34， 2004)。
尽管对于免疫原设计合成法是可能有效的一种方法，但是对于免疫 原的'合理，设计仍然存在着重要挑战。从最根本上来说，当用作为免 疫原时，抗原对抗体的亲和力并不一定与抗原引发相似抗体的可能性相 关。因此，非常希望能开发可选的设计能解决聚糖抗原性和聚糖免疫原 性固有限制的HIV疫苗的方法。
概述
本发明提供了 HIV疫苗和免疫原性组合物，产生上述疫苗和组合物 的方法以及接种疫苗和/或免疫的有关方法。根据一个实施方案， 一种产 生HIV疫苗或免疫原性组合物的方法包括 I) (A)改变表达系统的糖基化途径和
(B)在该表达系统中表达糖蛋白，使得所表达的糖蛋白具有经修饰 的糖基化，其增加所表达的糖蛋白对2G12抗体的亲和力或II)在不同于糖蛋白天然表达系统的表达系统中表达糖蛋白，其中所表
达的糖蛋白具有经修饰的糖基化，其增加所表达的糖蛋白对2G12的亲 和力。
根据另一个实施方案， 一种产生HIV疫苗或免疫原性组合物的方法 包括进行至少 一 次包含如下的重复
(i) 从第一个细胞库中选择一个细胞亚库，其中与第一个库的细胞 相比亚库的细胞具有对2G12抗体更高的亲和力；和
(ii) 复制亚库的细胞以产生第二个细胞库；其中疫苗或组合物包含 来自于最后一次重复的第二个库的细胞。
本发明的另一个方面是一种包含糖蛋白的HIV疫苗或免疫原性组 合物，其中糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖。
本发明的又一方面是一种包含对2G12抗体表位具有特异互补性的 甘露聚糖的HIV疫苗或免疫原性组合物。
本发明还提供了一种HIV疫苗或免疫原性组合物，包含
(i) 对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选择的甘露聚糖；和
(ii) 糖蛋白，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖。 根据又一个实施方案，本发明提供了针对HIV的接种疫苗和/或免
疫的方法，包i舌
给予患者包含糖蛋白的组合物，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要为高
甘露糖聚糖。
又一个实施方案是一种针对HIV的4妾种疫苗和/或免疫的方法，包
括
给予患者包含对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选择的甘露 聚糖的组合物。
以及又一个实施方案是一种针对HIV的接种疫苗和/或免疫的方 法，包括
给予患者包含糖蛋白的第 一组合物，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要 为高甘露糖聚糖，以及包含对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选 择的第二组合物，其中同时给予或分别给予第 一和第二组合物。
再一个实施方案是一种为本发明疫苗或免疫原性组合物所激发的抗体。
附图简述
图1A和1B显示了与几夫碱处理的HIV-lmBgpl20结合的抗体。 图2A和2B显示了在5 )LiM几夫碱存在下，来自HEK 293T细胞表
达的靶糖蛋白(RPTPmu)的PNGase F-释放的聚糖的MALDI-MS。
图3显示了正常的Man9GlcNAc2(上图)和在几夫石咸存在下来源于糖
蛋白的Man9GlcNAc2(下图)的特征结构指紋质谱分析。
图4显示了抗体与5 pM几夫石咸处理的CD48和RPTPmu的结合。 图5图解说明了显示a-联甘露糖(圓圏)和2G12的主要配体
Manal-2Manal-2Man (方框中)的酿酒酵母(S. ce〃v&^)甘露聚糖的结构。
图6显示了在三轮选择后2G12对酵母细胞表面的亲和力。
图7A和7B呈现的是对于在未处理的细胞(上图)和用几夫碱处理的
细胞(下图)中表达的CD66a自体糖蛋白，PNGase-F释放的聚糖的
MALDI-TOF分析。
图8呈现的是对于2G12与在几夫碱存在下所表达的CD66a糖蛋白
结合，酶联免疫吸附测定(ELISA)的数据。
发明详述
本发明涉及HIV疫苗、抗体和免疫原性组合物以及产生它们的方 法，具体来说，涉及糖类HIV疫苗和免疫原性组合物以及产生它们的方法。
可通过表达糖蛋白制备HIV疫苗或免疫原性组合物，所表达的糖蛋 白具有下述的糖基化修饰，即与未经修饰的天然糖基化的相同类型的糖 蛋白相比，所述糖蛋白对2G12抗体的亲和力增加。
糖基化的修饰可以是在具有改变的糖基化途径的表达系统中表达 糖蛋白或在不同于糖蛋白天然表达系统的表达系统中表达糖蛋白的结 果。
在本发明上下文中，改变糖基化途径指改变表达系统中的聚糖合成 的遗传基础和/或通过暴露表达系统于破坏/改变聚糖加工酶活性的化学 抑制剂以改变。
在本发明上下文中，术语"修饰的糖基化"意指在具有改变的糖基 化途径的系统中表达的糖蛋白的聚糖(寡糖)，与在该糖蛋白中天然存在 的聚糖至少有一处、优选多于一处不同。
糖蛋白的糖基化可以这样一种方式来修饰以致糖蛋白上的N-聚糖 主要为高甘露糖聚糖。术语"主要地"意指至少50%,优选至少75%, 更优选至少卯％以及最优选至少95%的N-聚糖为高甘露糖聚糖。高甘 露糖聚糖包括具有至少一个末端Manal,2Man键的聚糖。这样的寡糖的 例子是Man9GlcNAc2、 Man8GlcNAc2、 Man7GlcNAc2、 Man6GlcNAc2
或它们的异构体。优选地，糖蛋白的N-聚糖主要为Man9GlcNAc2或其
异构体。可利用已知技术鉴定N-聚糖分布图的内容物。例如，可利用 PNGaseF从糖蛋白释放N-聚糖并接着通过一次或多次高效液相层析、凝 胶电泳、质语分析。
在某些实施方案中，可通过将表达系统暴露于破坏/改变聚糖加工酶 活性的化学抑制剂改变该表达系统的糖基化途径。这样的抑制剂可以是 糖普酶抑制剂，优选为a-甘露糖苷酶抑制剂。表l呈现的是糖苦酶抑制 剂的例证性列表以及它们的活性。每种糖香酶抑制剂可单独使用或与其 他抑制剂组合使用。
表1. N-联糖基化途径初期糖苷酶的常见抑制剂
糖芬酶抑制剂__
Australine
栗精胺(Castonospermine )
脱氧野尻霉素
lj-二脱氧-l,4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)
脱氧甘露糖野尻霉素
几夫石成
6-脱氧-DIM
制甘糖酶素A 苦马豆素
D-甘露糖内酰胺氨基腙 (D-mannonolactam amidrazone) 丙基氨基甘露糖脒 (Propylaminomanno amidine)
糖苷酶_
a l-2糖苷酶I
a 1-2糖苷酶1
a 1-2糖苷酶II
高尔基体a-甘露糖苷酶II
高尔基体al-2甘露糖苷酶I
高尔基体a 1-2甘露糖苷酶I
高尔基体a-甘露糖苷酶II
高尔基体a-甘露糖苷酶II
高尔基体a-甘露糖苷酶II
a-甘露糖苷酶
a-甘露糖普酶
糖普酶抑制剂的具体浓度可取决于抑制剂的类型、被表达的糖蛋白 的类型。例如，可将不大于约100pM或不大于约50jiM或不大于约10 liiM或不大于约5 iuM或不大于约1 ^M或不大于约0.5 jxM浓度的优选的
甘露糖苦酶抑制剂——几夫碱与表达系统的细胞接触。
本发明的表达系统可以是高产量的哺乳动物表达系统，例如人胚肾
293T-E和S细胞(HEK293T)、中国仓鼠卵巢(CHO)和HepG2细胞.
在某些实施方案中，可通过遗传操作糖基化途径改变表达系统的糖 基化途径。因此，表达系统可以是包含破坏的N-联糖基化以产生承载甘 露寡糖聚糖的糖蛋白的哺乳动物表达系统，例如可以是缺乏a-甘露糖苷 酶和/或GlcNAc-转移酶I活性的表达系统。表达系统还可以是凝集素抗 性细胞系，包括缺乏ct-甘露糖苷酶和/或GlcNAc-转移酶I活性的细胞 系。
在某些实施方案中，还可在任何不同于糖蛋白天然表达系统的表达 系统中进行糖蛋白的表达，该表达系统修饰了糖蛋白的糖基化使得其与 相同类型的天然存在的糖蛋白相比具有增加的对2G12的亲和力。具体 来说，所预期的表达系统包括具有改变的N-联糖基化基因的真菌/酵母 细胞系、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系，例如能表达具有高甘露糖结构 的糖蛋白的Lec-系列突变体。酵母细胞系例如可以是酿酒酵母△ ochl、 △ mnnl突变体(Nakanishi-Shindo, Y., Nakayama, K. L, Tanaka, A., Toda, Y.和Jigami, Y. (1993). Journal of Biological Chemistry 268: 26338-26345)。
以这样一种方式修饰表达的糖蛋白的糖基化，以致与具有天然糖基 化的相同类型的糖蛋白相比该糖蛋白对2G12抗体的亲和力增加。存在 着用于测定糖蛋白对抗体亲和力的常规方法。这样的方法的 一 个例子可 以是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
根据本发明可被表达的糖蛋白包括gpl20糖蛋白和"自体"-糖蛋 白。糖蛋白可获得自任何适宜的来源，例如通过标准重组技术产生糖蛋 白。
朋，
天然存在的gpl20的糖基化是高度不均一的。对于2G12结合所必 须的al-2联结构仅出现在较大的甘露寡糖聚糖上。因此，通常与2G12 结合的两个或三个gpl20聚糖仅仅是出现在gpl20上(多达30个N-联位 点)的N-联糖类总数的一小部分。
因此，gpl20糖基化微观不均一性的程度限制了 2G12和其他类似 的抗聚糖抗体结合位点的数目。该更多可变的复合物、杂合型和较小的 甘露寡糖聚糖不能支持2G12结合。通过操纵聚糖加工途径以将gpl20 上的聚糖类型限定为那些与2G12结合的类型，就可以克服这种限制。 这种修饰的结果是增加了该免疫原的潜力，引发了其他与2G12具有类 似特异性的抗体。因此，在几夫碱存在下所产生的gpl20不仅能作为 2G12的增强配体，还能潜在地用于任何其他需要甘露糖残基以其他几 何形状存在的抗甘露糖簇抗体。 緣f ^
对gpl20的免疫应答通常受控于特异于蛋白内核的抗体。在抗体识 别中N-联聚糖并不通常起直接作用。为消除对蛋白部分的免疫应答以及 蛋白部分的免疫调控，'自体'蛋白可用作为'非自体，甘露寡糖簇的 支架结构。在甘露糖苷酶抑制剂存在下或来自具有遗传操作的糖基化途 径的细胞系，重组'自体，糖蛋白的表达可提供具有甘露寡糖型聚糖的 支架结构，其模拟2G12表位。该方法的优点在于2G12表位可存在于具 有只直接针对甘露寡糖簇的任何抗体应答的免疫沉默的蛋白支架结构 中。
本发明还提供了包含具有对2G12抗体特异互补性的甘露聚糖的 HIV疫苗或免疫原性组合物。甘露聚糖是含有甘露糖的多糖，优选来自 酵母或细菌细胞。甘露聚糖可以分离的甘露聚糖；全酵母或细菌细胞， 其可以是被杀死的细胞或减毒的细胞；或与载体分子或蛋白偶联的甘露 聚糖的形式存在。对于酵母或细菌细胞，甘露聚糖可以是对2G12抗体 具有天然亲和力的甘露聚糖。这样的甘露聚糖的 一 个例子可以是模拟 2G12表位的白色念珠菌(Ow^6/" a/6,ca朋)的甘露聚糖结构，即具有对 2G12抗体的天然特异互补性。
甘露聚糖还可以是人工或遗传选择的甘露聚糖。可通过重复选择具 有对2G12抗体更高亲和力的酵母或细菌细胞产生这样的甘露聚糖。用 于该重复过程的起始细胞库可包含具有某些非零亲和力或特异性的细 胞。从该起始库开始，可选择与剩余细胞相比具有对2G12抗体更高亲 和力的细胞亚群。然后，可复制细胞亚群并用作为起始库用于随后的重 复选择。不同的标准可用于鉴定具有对2G12抗体更高亲和力的细胞亚 群。例如，在第一次重复选4奪中选择具有对2G12抗体可才企测的亲和力 的细胞。在随后的重复选一奪中，所选4奪的细胞可以是表现显示对2G12 抗体高亲和力的细胞。使用荧光激活细胞分选仪(FACS)或通过利用固定 的2G12的亲和分离直接富集，可选择显示对2G12抗体高亲和力的细
胞。
可用作为起始库细胞的 一个非限制性例子是酿酒酵母细胞。因此，
2G12抗体能结合酿酒酵母甘露聚糖，就表明在甘露聚糖和gpl20糖蛋 白之间存在某种非零程度的抗原模拟。酿酒酵母细胞壁的糖类结构与 gpl20的甘露寡糖聚糖享有共同的抗原结构。然而，天然存在的酿酒酵 母甘露聚糖当用作为免疫原时，并不诱导足够的对gp 120的体液交叉反应性。
可用于本发明的细胞还可以是缺少 一 种或多种负责甘露聚糖合成 的基因的细胞，例如缺少甘露糖转移酶基因产物Mnn2p的细胞。
可给予疫苗或免疫原性组合物，用于抗HIV的针对包括人的哺乳动 物HIV的接种疫苗和/或免疫。疫苗或免疫原性组合物可包括具有对 2G12抗体特异互补性的甘露聚糖和/或根据上述方法制备的糖蛋白。可 包括于疫苗中的糖蛋白为其糖基化不再修饰的分离的或纯化的糖蛋 白。
可通过任何适宜的方式给予疫苗或免疫原性组合物。例如，糖蛋白 和/或甘露聚糖可作为进一步含有药学上可接受的载体的药学上可接受 的组合物的一部分或通过诸如脂质体或控制释放药物组合物的递药系 统给予。术语"药学上可接受的"指生理学上可接纳的并且当给药时通 常不产生变应性或类似不需要的反应例如胃不适或头晕的分子和组合 物。优选地，"药学上可接受的，，意指为联邦或州政府管理机构所核准
的或列于美国药典或其他公认供动物优选人使用的药典中的。术语"载 体"指与化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药
物载体可以是无菌液体，例如盐水溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、水和 油乳剂例如那些用矿物、动物、植物或合成来源的油类(花生油、大豆油、 矿物油或芝麻油)制备的。水、盐水溶液、葡萄糖溶液以及甘油溶液优选 用作为载体，特别是用于可注射的溶液。
可通过任何与糖蛋白和/或甘露聚糖相容的标准技术给予疫苗或免 疫原性组合物。这样的技术包括肠胃外、经皮和转化粘液质如口服或鼻 内给药。
下列非限制性实施例进一步阐明了本发明。 实施例1.在甘露糖苷酶抑制剂存在下产生的gpl20增加了抗原性 该研究的目的在于产生能优先地引发广泛中和2G12-样抗-HIV抗体 的修饰的gpl20分子。利用甘露糖普酶抑制剂在中国仓鼠卵巢(CHO)稳 定细胞系中产生HIV-l/朋gpl20糖蛋白，利用甘露糖苷酶抑制剂的目的 在于修饰糖蛋白以具有对2G12更高亲和力的甘露寡糖表位。
为研究通过几夫碱抑制甘露糖苷酶对形成2G12表位所起的作用， 在补充有胎牛血清(10%)、青霉素(50 U/ml)和链霉素(50 ^g/ml)的CB2 DMEM基础培养基中培养分泌重组HIV-1IIIB gpl20的用 EE6HCMVgp 120GS转染的中国仓鼠卯巢(CHO)细胞。所有的试剂均获得 自Gibco Ltd, Uxbridge, UK。通过添加甲硫氨酸砜亚胺(200 nM)保持 gpl20的高表达。在几夫碱存在或不存在下培养细胞(参见图1A, 1B)。
尽管几夫碱和脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ,表l)都抑制内质网和高 尔基体驻留的I类a-甘露糖普酶，但在该研究中选择几夫碱作为甘露糖 苷酶抑制剂，因为与DMJ相比其能以1000-倍更低的浓度实现对甘露糖 苷酶抑制。
在甘露糖普酶抑制剂几夫碱存在下所产生的CHO gpl20产生了在 酶联免疫吸附测定(ELISA)中显示对单克隆抗体2G12更高结合的分子。 两个2G12 ELISA结合测定证明了在几夫石咸存在下所产生的gpl20的每 个分子上存在至少一个额外的2G12结合位点。将糖蛋白固定在塑料蛋 白结合平板上。对于第一次实验(图1A),用2G12(5ug/ml)包被平板，在 4。C下放置过夜。接着用牛血清白蛋白(3% w/v)封闭平板1小时。随后， 在室温下添加来自表达gpl20IIIB的CHO细胞(存在或不存在几夫^咸)的 上清液，持续1小时。接着在PBS中洗涤平板3次。然后添加2G12(滴 定到10yg/ml)。在洗涤后，通过磷酸酶缀合的抗-IgG第二抗体检测2G12 结合，最后进行洗涤步骤以及接着进行磷酸酶底物测定(对硝基苯酚磷酸 盐，在40Snm处的吸光度)。
通过M2结合(图1B)测定额外的结合位点的存在，通过用不与 2G12或b12结合位点竟争的抗gpl20抗体(D7324)捕捉gpl20进行该测 定。通过磷酸酶缀合的抗IgG第二抗体再次测定gpl20的结合以及 bl2/2G12的测定。
图]显示了通过来自用于确定2G12浓度的磷酸酶缀合的抗IgG第 二抗体以及对照抗体(ug/ml)在405nm处的吸光度所;险测的对几夫力咸处 理的gp]20糖蛋白的抗体结合。图1A显示了表示多于一个的2G12分子 与在O]iM几夫碱(空心菱形)、O.O5 )iM几夫碱(空心三角形)、0.1 ^M几 夫碱(空心正方形)、0.25 pM几夫碱(+)、 0.5 几夫碱(实心三角形)、1 ]LiM几夫碱(实心三角形)以及5 pM几夫碱(实心正方形)存在下产生的 CHOgpl20结合的夹心ELISA结果。在这些实^r中BSA(x)用作为阴性 对照。图1B显示了 2G12与几夫碱处理的CHO gpl20的双抗体结合， b12与未处理的gpl20结合(实正方形)、2G12与未处理的gpl20结合(实 心菱形)、bl2和2G12双抗体与gpl20结合(实心三角形)；M2(空心正方 形)和2G12(空心菱形)与在5 )LiM几夫碱存在下产生的gpl20结合。来自 于夹心ELISA测定的结果显示在具有增加的几夫碱浓度下，更高比例的 gpl20分子能同时与两个或更多个2G12抗体分子结合(图1A)。将2G12 与几夫碱处理的gpl20的结合与未处理的gpl20的双抗体ELISA进行比 较(图1B),证实了在几夫碱处理的gpl20上存在两个不同的针对2G12 的表位。
结论几夫碱处理的糖蛋白的N-聚糖分析显示复合物糖基化被阻 止，导致甘露寡糖糖形产生，与已知的几夫碱对内质网以及高尔基体驻 留的甘露糖苷酶的抑制活性相符合。作为结果，2G12与在几夫碱存在 下表达的gpl20糖蛋白的结合显著地增加了 ，至少两个2G12分子能与 一个gpl20分子结合。
实施例2.具有对HIV糖类抗原交叉反应性的'自体，糖蛋白的产生 a) CD 48和RPTPmu
该研究的目的在于产生承载与2G12抗体结合并因此展示与HIV gpl20抗原交叉反应性的甘露寡糖聚糖的'自体'糖蛋白。在5pM浓度 的甘露糖苷酶抑制剂几夫碱存在下，于HEK293T细胞中表达两种靶糖 蛋白，CD48和受体蛋白酪氨酸磷酸酶mu(RPTPmu)。为证实在产生含 有甘露寡糖聚糖的糖蛋白中甘露糖苷酶抑制剂是有效的，通过用蛋白N-聚糖酶F(PNGase F)消化释放聚糖并接着利用高效液相层析(HPLC)和基 质辅助激光解吸与电离质谱(MALDI-MS)进行分析。
通过蛋白N-聚糖酶F消化从重组糖蛋白中释放了聚糖，其描述于 Kurster等(Anal. B腦hem. 250(1)82-101)，简单来说通过10% SDS PAGE 分离蛋白并将凝胶上的考马斯染色条带切下并冷冻在-20 。C下。然后用 乙腈和20 mM碳酸氬钠緩沖液交替洗涤冷冻的凝胶碎片。接着通过在
20 mM碳酸氢钠緩冲液中于37 °C下用PNGase F (EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)酶促消化过夜去糖基化。保留含有聚糖的过夜反应混合物 并通过超声处理添加有蒸馏水的凝胶碎片抽提所有留在凝胶中的聚 糖。所抽提的聚糖最后通过Micropure-EZ酶结合柱(Millipore, Bedford,
MA, USA)纯化用于质谱分析。
此外，在用糖苷外切酶和糖苷内切酶消化后分析聚糖。图2呈现的 是从在5 )uM几夫碱存在下于HEK 293T细胞中表达的靶糖蛋白 (RPTPmu), PNGase F-释放的聚糖的MALDI-MS。未消化的聚糖以及用 糖香内切酶H消化的聚糖的数据相应地示意于图2的A和B。图2的结 果证实了所释放的聚糖组合全都对糖苷内切酶H消化以及来自于刀豆 的a-甘露糖普酶敏感。
通过ELISA对所产生的含有甘露寡糖型N-联聚糖的糖蛋白测试与 2G12的结合(图4)。具体来说，将15.6pg的CD48, 2 )iig、 1 和0.4 的RPTPmu置于平板上并将1 )ig的无几夫石咸处理的IgG置于平板上作为 阴性对照。图4的数据证实了在甘露糖苦酶抑制剂存在下产生的糖蛋白 能结合2G12，并因此成为HIV包膜糖蛋白gpl20的抗原才莫拟物。
出现在几夫碱存在下表达的糖蛋白上的聚糖的抗原性重要特征是 产生非天然的甘露寡糖异构体。在某些表达系统中，特别是HEK 293T 细胞，几夫碱的导入能引起Man9GIcNAc2的合成，尽管其与天然异构体 具有相同的化学组成，但含有不同的组分单糖排列。图3比较了正常的 Man9GlcNAc2(上图)和衍生自在几夫石咸存在下表达的糖蛋白的 Man9GlcNAc2(下图)的特征结构指紋质语分析，证实了存在抗原性新的 Man9GlcNAc2异构体。
因为出现在来源于几夫碱处理的细胞的糖蛋白上的非天然异构体 具抗原性，与通常出现在包括HIV的哺乳动物细胞上的Man9GlcNAc2 截然不同，因此可预期来源于几夫碱处理的细胞的糖蛋白当用作为免疫 原时能显示增强的抗原应答。因此，修饰现有Man9GlcNAc2结构可改善 上述簇效应的免疫原性。
如图3所示，来自几夫碱处理的HEK293T细胞的甘露寡糖聚糖是 抗原性'非自体，异构体。因此，在同时保留有对gpl20天然聚糖的抗 原交叉反应性下，这些新的聚糖还显示增加的免疫原性容量。
b) CD66a
CD66a (CEACAM-1)自体糖蛋白是在50 pM浓度的甘露糖苷酶抑制 剂几夫碱存在下于HEK293T细胞中表达的。在具有10%FCS、 100U/ml 青霉素、100ug/ml链霉素以及0.6mg/mlG418的达尔伯克氏改良伊格尔 氏培养基(DMEM)中培养用与人Fc融合的大鼠CEACAM1转染的 HEK293细胞。让该Fc嵌合蛋白积累10天并利用高流速蛋白A-Sepharose (Amersham Biosciences)进行纯化。
蛋白质印迹分析
让洗脱的蛋白跑10% SDS PAGE并利用槽式转移装置(Bio-Rad, Hertfordshire, UK)电印迹到PVDF膜(Immobillon-P, Millipore)上。使用 1:500稀释的单克隆抗CEACAM1小鼠单克隆抗体Be9.2 (B.B.Singer博 士友好提供的)和HRP缀合的抗小鼠抗体(1:10,000稀释)进行免疫印迹。 使用增强化学发光技术(ECL, Pierce, Northumberland, UK)开发HRP-依 赖的发光。
PNGase消化和聚糖抽提
通过分离10% SDS PAGE纯化的大鼠CEACAM1蛋白并将凝胶上 的考马斯染色条带切下并冷冻在-2(TC下。然后用乙腈和20mM碳酸氬 钠緩冲液交替洗涤冷冻的凝胶碎片。接着通过在20 mM碳酸氬钠緩沖 液中于37 °C下用PNGase F (EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)酶促消化 过夜去糖基化。保留含有聚糖的过夜反应混合物并通过超声处理添加有 蒸馏水的凝胶碎片抽提所有留在凝胶中的聚糖。
所抽提的聚糖最后通过Micropure-EZ酶结合柱(Millipore, Bedford, MA， USA)纯化用于质谱分析。
为证实在产生含有甘露寡糖聚糖的糖蛋白中甘露糖苷酶抑制剂是 有效的，通过用蛋白N-聚糖酶F(PNGase F)消化释放聚糖并接着利用基 质辅助激光解吸与电离-飞行时间质镨(MALDI-TOF-MS)进行分析。
图7呈现的是对通常出现在CD66a即在未处理的细胞中表达的 CD66a上的聚糖(上图)以及对从几夫碱存在下表达的CD66a中释放的聚 糖(下图)进行MALTI-TOF-MS分析的结果。通常出现在CD66a上的聚 糖形成不同的复杂N-联糖类组合，而来自在几夫碱存在下表达的CD66a 的聚糖则是主要为GlcNAc2Man9的甘露寡糖聚糖。这种聚糖复杂性的 减少与图8中CD66a对2G12抗体亲和力的增加相关。通过ELISA测定 2G12与固定的CD66a的结合。还通过与通常出现的CD66a (-)相比，对
在几夫碱存在下表达的CD66a (+)所观察到的凝胶位移更低、更聚焦、 可见聚集证实了几夫碱处理对CD66a上聚糖多样性的效果。
实施例3. 2G12与遗传选择酵母表面甘露聚糖的结合
选择酵母甘露聚糖所采取的策略是获取已有的免疫原性糖类结构
(酿酒酵母甘露聚糖)并增加其与gpl20的抗原相似性。为了该研究，挑 选野生型酿酒酵母(WT Mat-a B4741 )和甘露糖转移酶基因产物Mnn2p缺 陷的菌才朱(Z(A/""2 Mat-a B4741)。许多其他病原体表面可共享有该结构， 或可以通过进4t人工选才奪以进4t出该结构。具体来i兌，选4奪z!W""2突 变体是因为其的添加为Mnn2p所催化的支链甘露聚糖末端Manal-3Man 残基，应可料到会阻碍2G12识别(图5)。可通过荧光激活细胞分选仪 (FACS)测定2G12与酿酒酵母甘露聚糖的结合。选择展示对2G12可检 测的亲和力的细胞并用于产生子细胞群。重复几轮选择可驱动对2G12
更高亲和力的酵母甘露聚糖的进化。
图6显示了三轮选择后2G12对酵母细胞表面的亲和力。y-轴值表 示与99.5%的初始WT群相比，与2G12具有更高亲和力结合的酵母细 胞级分。图6中显示了 WT(清晰的条)和zJM朋2(带阴影的条)群的进化。 图6的数据显示根据它们结合2G12能力所进行的酵母选择能产生可遗 传的对细胞表面的2G12亲和力的增加。与WT相比，作为预期的Z)A^7"2 菌抹能更好地支持这样的对选择标准的适应。额外轮次的选择和重复能 继续改变甘露聚糖结构，并因此增加它们对2G12表位的抗原^t拟。因 此，无论是以分离状态还是作为蛋白缀合物产生的甘露聚糖结构可用于 免疫研究。
虽然前文指出了具体的优选实施方案，但是很清楚的是本发明并不 受限于此。本领域技术人员会想到多种可对所披露的实施方案进行的修 改，并且这样的修改意在落入本发明的范围之内。
所有在该说明书中引用的出版物、专利申请以及专利以其全文在此 并入作为参考。
权利要求
1.一种产生HIV疫苗或免疫原性组合物的方法，包括I.(A)改变表达系统的糖基化途径，和(B)在该表达系统中表达糖蛋白，使得所表达的糖蛋白具有经修饰的糖基化，其增加所表达的糖蛋白对2G12抗体的亲和力；或II.在不同于所述糖蛋白天然表达系统的表达系统中表达糖蛋白，其中所表达的糖蛋白具有经修饰的糖基化，其增加所表达的糖蛋白对2G12的亲和力。
2. 权利要求1的方法，其中所述改变包括遗传操作导致甘露糖苷酶 缺陷细胞系的糖基化。
3. 权利要求1的方法，其中所述改变包括让所述表达系统与a-甘露 糖普酶抑制剂接触。
4. 权利要求3的方法，其中a-甘露糖苷酶抑制剂是Australine、栗 精胺、脱氧野尻霉素、1,4-二脱氧-l,4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、脱氧甘 露糖野尻霉素、6-脱氧-DIM、制甘糖酶素A、苦马豆素、D-甘露糖内酰 胺氨基腙或丙基氨基甘露糖脒。
5. 权利要求4的方法，其中a-甘露糖苷酶抑制剂是几夫碱。
6. 权利要求l的方法，其中糖蛋白是gpl20糖蛋白。
7. 权利要求l的方法，其中糖蛋白是自体糖蛋白。
8. 权利要求7的方法，其中自体糖蛋白为CD48、 CD29、 CD49a、 CD66a、 CD80、 CD96a、氨肽酶或RPTPmu。
9. 权利要求7的方法，其中自体糖蛋白为可溶性糖蛋白构建体。
10. 权利要求l的方法，其中表达的糖蛋白的N-聚糖主要是非糖基 化的高甘露糖聚糖。
11. 权利要求10的方法，其中所述高甘露糖聚糖选自 Man9GlcNAc、 Man8GlcNAc、 Man7GlcNAc、 Man6GlcNAc聚糖。
12. 权利要求1的方法，其中具有修饰的糖基化的糖蛋白的表达在高产量的哺乳动物表达系统中进行。
13. 权利要求12的方法，其中高产量的哺乳动物表达系统包括HEK 293T细胞、CHO细胞或HepG2细胞。
14. 权利要求1的方法，进一步包括添加N-联糖基化位点到糖蛋白上。
15. —种通过权利要求1的方法产生的HIV疫苗或免疫原性组合物。
16. —种HIV疫苗或免疫原性组合物，包含具有修饰的糖基化的糖 蛋白，以使得所述糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖。
17. 权利要求16的疫苗或组合物，其中所述糖蛋白为gpl20糖蛋白。
18. 权利要求16的疫苗或组合物，其中所述糖蛋白为自体糖蛋白。
19. 一种产生HIV疫苗或免疫原性组合物的方法，包括进行至少一 次包含如下的重复(i) 从第一个细胞库中选择一个细胞亚库，其中与第一个库的细胞 相比亚库的细胞具有对2G12抗体更高的亲和力；和(ii) 复制亚库的细胞以产生第二个细胞库；其中疫苗或组合物包含 来自于最后一次重复的第二个库的细胞。
20. 权利要求19的方法，进行所述重复两次或更多次，其中非最后 一次重复中的第二个细胞库作为紧接着该非最后一次重复之后的一个 重复中的第一个细胞库。
21. 权利要求19的方法，其中第一个库的细胞为酵母细胞。
22. 权利要求21的方法，其中酵母细胞为白色念珠菌(Ow6/Wa a/6,ca朋)细月包或酿酒酵母(&ce,/v,^e)细月包。
23. 权利要求21的方法，其中所述酵母细胞缺乏一种或多种负责甘 露聚糖合成的基因。
24. 权利要求19的方法，其中所述的选择通过荧光激活细胞分选仪 或通过利用固定的2G12抗体亲和分离直接富集进行。
25. —种通过权利要求19的方法产生的HIV疫苗或免疫原性组合
26. —种HIV疫苗或免疫原性组合物，包含对2G12抗体表位具有 特异互补性的甘露聚糖。
27. 权利要求26的疫苗或组合物，其中所述甘露聚糖为酵母或细菌 细胞的甘露聚糖。
28. 权利要求26的疫苗，其中所述甘露聚糖为人工选择的甘露聚糖。
29. —种HIV疫苗或免疫原性组合物，包含(i) 对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选择的甘露聚糖；和(ii) 糖蛋白，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖。
30. —种针对HIV接种疫苗和/或免疫的方法，包括给予患者包含糖 蛋白的组合物，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖。
31. —种针对HIV的接种疫苗和/或免疫方法，包括 给予患者包含对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选择的甘露聚糖的组合物。
32. —种针对HIV的接种疫苗和/或免疫的方法，包括 给予患者包含糖蛋白的第一组合物，其中所述糖蛋白的N-聚糖主要为高甘露糖聚糖，以及包含对2G12抗体表位具有特异互补性的人工选 择的第二组合物，其中同时给予或分别给予第 一和第二组合物。
全文摘要
提供了产生糖类HIV疫苗或免疫原性组合物的方法。一种方法包括表达具有修饰的糖基化的糖蛋白，其利于该糖蛋白与2G12抗体的结合。另一种方法包括重复选择具有对2G12抗体高亲和力的细胞。
文档编号C12P1/02GK101351222SQ200680016944
公开日2009年1月21日 申请日期2006年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者C·斯坎兰, G·里奇, M·D·M·克里斯平, P·M·鲁德, R·A·德韦克 申请人:牛津大学