专利名称：Stat4基因作为牛乳质性状相关的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛的分子标记辅助选择技术领域，尤其是一种STAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记及其应用。
背景技术：
作为奶牛生产重要的经济性状，乳质性状主要包括乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量和乳脂率等方面，属典型的微效多基因控制的数量性状，可直接影响牛奶的营养、风味和牛奶产业的经济效益。虽然正常情况下乳成分基本保持稳定，但乳脂和乳蛋白等成分会因生理和遗传因素在一定范围内产生波动并影响乳 品质，因此亟需依据市场和人类营养学的需求，利用功能基因和功能性单核苷酸多态性分子标记改善牛奶品质。哺乳动物的信号转导与转录激活因子(signal transduction and activator oftranscriptions, STATs)家族介导了多种生物学反应，可与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，直接联系细胞外信号、参与目的基因表达调控，从而调控包括细胞生长、分化、凋亡及免疫反应等多种重要的生物过程。作为Jak蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase,JAK)的靶蛋白，在哺乳动物中已发现7种STAT蛋白，即STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。与其他STAT蛋白不同，STAT4是STAT蛋白家族中惟一限定组织分布的成员，主要分布在淋巴和髓系组织中。该蛋白主要由IL-12激活，在Thl/Th2的分化调控及因此失调引发的各种炎症性疾病中发挥着重要的作用。目前的研究显示乳腺组织中可检测到除STAT2外的其他6种STAT蛋白，且乳腺发育过程中的STAT蛋白以STAT1-STAT4-STAT6-STAT5-STAT3-STAT1的方式被连续激活，每个成员均在该过程中发挥各自特有的功能。在乳腺发育过程中，STAT4基因的表达存在变化，虽然人们尚不确定STAT4在乳腺发育过程中的特定功能，但是该蛋白与乳腺发育过程密切相关。另外，在该基因内已经发现了存在与牛乳质性状相关的分子标记。因此，申请人开展了牛STAT4基因内含子19序列的克隆、SNP筛查与检测及其与牛乳质性状的关联分析。
发明内容
本发明的目的正是要解决上述技术存在的不足，而提供一种STAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记及其应用，一种作为牛标记辅助选择的、与牛乳质性状相关的分子标记的克隆及应用，本发明的分子标记与STAT4基因有关。本发明目的在于克隆与牛乳质性状相关的分子标记，利用该分子标记作为牛标记辅助育种的应用。本发明解决其技术问题采用的技术方案本发明克隆得到一种与牛乳质性状相关的分子标记，它是序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO 1的146bp处有一个G146-A146的碱基替换，280bp处有一个G280-C280的碱基颠换。所发现的G146-A146的碱基替换和280bp处G280-C280的碱基颠换为2个单核苷酸连锁突变，因此这2个突变仅出现GGGG、GAGC和AACC这3种单倍型。其中克隆牛STAT4基因的引物对的DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所本发明建立一种制备上述分子标记和检测上述分子标记的方法，该方法的步骤如下用牛STAT4基因设计引物，扩增得到目的片段；从牛外周血中提取基因组DNA，以牛STAT4基因DNA序列为模板设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，应用PCR-SSCP方法检测牛STAT4基因的多态性，并初步进行了其基因型与牛乳质性状之间的关联分析的应用，为牛的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。本发明有益的效果是从牛STAT4基因中克隆获得一种作为分子标记应用的与牛乳质性状相关的基因片段，公开了扩增STAT4基因部分内含子区所用的引物以及用于分子标记的检测方法。本发明为牛的标记辅助选择提供了 2个新的分子标记。
图I :是本发明的技术流程图。图2:是本发明中牛STAT4基因内含子19扩增序列的电泳图谱，片段大小为310bp (琼脂糖胶浓度为1.5% )0图中M为DNA分子量标记(DL2000plus)。图3 :中国荷斯坦奶牛STAT4基因内含子19突变纯合型BB基因型个体序列的与牛全基因组数据库BLAST比对结果。图4:是本发明中牛STAT基因内含子19突变纯合型个体测序发现SEQ ID N01的146bp处有一个G146-A146的碱基替换，280bp处有一个G280-C280的碱基颠换，两个突变为两个单核苷酸连锁突变。图5 :是本发明中牛STAT4基因内含子19PCR-SSCP的3种基因型(AA、AB和BB各对应146bp处和280bp处GGGG、GAGC和AACC这3种基因型。)
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆及用于PCR-SSCP检测的牛乳质性状相关基因STAT4基因内含子19的DNA序列。序列表SEQ ID NO 2是本发明中用于克隆及PCR-SSCP检测牛乳质性状相关基因STAT4基因内含子19DNA突变的PCR-SSCP上游引物。序列表SEQ ID NO 3是本发明中用于克隆及PCR-SSCP检测牛乳质性状相关基因STAT4基因内含子19DNA突变的PCR-SSCP下游引物。实施例I :STAT4基因内含子19序列的克隆(制备实施例)I.引物设计利用牛STAT4基因DNA序列(GenBank收录号NC 007300. 5)设计了一对用于扩增牛STAT4内含子19的引物。引物由美国Invitrogen英杰生命技术有限公司上海办事处合成，引物对的DNA序列如下
正向引物5'-GAGCGGTTAGTAATCAGTAGCTAGA-3'(对应 SEQ ID NO :2)，反向引物5'-GGAGGGGATGAAGCATAAAGACC-3'(对应 SEQ ID NO :3)。2. PCR产物的扩增、纯化和测序(I) PCR 扩增25 μ L 的反应体系中加入 50ng/y L 的 DNA 模板 2 μ L，10XPCR Buffer 2. 5 μ L,
2.5mMdNTP I μ L，IOmM正、反向引物各0. I μ L，Taq酶1U，双蒸水至25 μ L。PCR反应程序如下94°C预变性 5min ;94°C变性 10sec，6rC复性 10sec，72°C延伸 20sec，35 个循环；72°CIOmin ;4°C保存。PCR产物经I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。、(2) PCR产物的纯化和测序足量的PCR产物经I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离后，在琼脂糖凝胶中切割分子量为310bp的目的片段,利用E.Z.N.A8.胶回收试剂盒(Omega)进行纯化后,送美国Invitrogen英杰生命技术有限公司上海办事处进行测序。(3) DNA序列同源性检索鉴定及突变位点的确定通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank牛全基因组数据库中公布的数据进行比对，结果显示克隆的序列位于牛STAT4基因内含子19(图3)。而该基因在2个位点发生了基因突变。这2个位点分别是在SEQ ID NO 1的146bp处有一个G146-A146的碱基替换，280bp处有一个G280-C280的碱基颠换(图4)。所发现的G146-A146的碱基替换和280bp处G280-C280的碱基颠换为2个单核苷酸连锁突变，因此这2个突变仅出现野生纯合型GGGG、突变杂合型GAGC和突变纯合型AACC这3种单倍型。实施例2 STAT4PCR-SSCP基因型检测方法的建立取5 μ L正、反向引物的PCR扩增产物，与10 μ L上样缓冲液(98 %甲酰胺、O. 025 %二甲苯氰、2%甘油、O. Olmmol · L-1EDTA)混合，瞬时离心后放于PCR仪中99°C变性lOmin，并立即置于冰上，冰浴30min后上样于15%非变性聚丙烯酰胺凝胶，4°C，180V、200mA条件下电泳12 15h。电泳结束后，取胶进行银染显带，判定基因型。PCR扩增产物的SSCP分析发现AA、AB和BB 3种基因型，其中AA型为野生纯合型，对应GGGG单倍型；BB型为突变纯合型，对应AACC单倍型；AB为突变杂合型，对应GAGC单倍型(图5)。实施例3 STAT4PCR-SSCP多态性在中国荷斯坦牛中的分布状态检测利用PCR-SSCP检测了中国荷斯坦牛STAT4内含子19内突变的基因型和等位基因频率。结果显示，检测中国荷斯坦牛群体中STAT4基因内含子19内的突变以等位基因A (即野生型，146G和280G)为主，达到0. 6667，等位基因B (即突变型，146A和280C)的等位基因频率为0. 3333 (表I)。STAT4基因内含子19SNPs多态信息含量为0. 3457，属中度多态，表明STAT4基因内含子19SNPs的遗传变异较大，可望获得更多的选择效果。SNPs x 2适合性检验结果表明，中国荷斯坦群体在该位点已经达到Hardy-Weinberg平衡状态(P > 0. 05)。表I中国荷斯坦牛STAT4基因内含子19突变的基因型和等位基因频率
实施例4 :本发明克隆的分子标记在牛乳质性状关联分析中的应用(应用实施例)(I)基因型扫描用于关联分析的乳质性状分析的219头I 3胎中国荷斯坦奶牛尾静脉血液样品(EDTANa抗凝)均采自浙江省金华市伊康乳业奶牛场核心群。试验个体在泌乳期内均参加了奶牛群体改良计划(Dairy herd improvement, DHI),具有完整泌乳期生产数据,试验个体每月进行一次DHI测定，日挤奶3次。试验个体均使用丹麦FOSS的CombiFoss FT+乳成分及体细胞分析仪测定体细胞数、乳蛋白率、乳蛋白量等泌乳性状。其中试验个体的产奶量及泌乳性状测定值均已校正为305天校正产奶量及泌乳性状测定值。由于未转换的的体细胞数(somatic cell count, SCC)广泛偏离正态性和齐性分布，需将体细胞数转化为体细胞评分后进行关联分析。体细胞评分(Somatic cell score,SCS) = [log2(SCC/100)]+3，其中 SCC 单位为 1000/mL。应用PopGen32软件计算STAT4突变基因型频率、等位基因频率、多态信息含量。使用统计软件包SPSS17. O中的Generalized Linear Models构建STAT4突变位点与中国荷斯坦奶牛乳脂率、乳蛋白率、305天校正产奶量、305天校正乳脂量、305天校正乳蛋白量及体细胞评分6个性状的一般线性模型Yij = μ i+Mj+eijk ①其中Yij为中国荷斯坦奶牛乳脂率、乳蛋白率、305天校正产奶量、305天校正乳脂量、305天校正乳蛋白量及体细胞评分测定值；μ i为群体最小二乘均值;Mj为基因型(3个水平AA、AB和BB)的固定效应；eijk为残差效应。由于用于基因型效应分析的个体均来自于同一饲养场的同一群体，因此模型中不包含场效应和品种效应。基因型效应分析中加性效应(additive effect, a) = (AA-BB)/2,显性效应(dominant effect, d) = AB-(AA+BB)/2。A等位基因的平均效应al = q [a+d (q-p) ] ;B等位基因的平均效应α 2=-p[a+d(q_p) ] ,A等位基因代替B等位基因的平均效应α = a I-a 2 = a+d (q-p),其中P为A的等位基因频率；q为B等位基因频率。以模型①分析中国荷斯坦奶牛受试群体STAT4基因内含子19突变与乳质性状的关联分析结果表明，各基因型与奶牛305天校正乳蛋白量呈现显著关联(P < 0. 05)，与乳脂率呈现极显著关联(P < 0. 01)，各基因型305天校正乳蛋白量呈现出GAGC > GGGG > AACC的趋势，乳蛋白率、乳脂率呈现出AACC > GAGC > GGGG的趋势(表2)。单基因效应分析表明，STAT4基因内含子19突变对305天校正产奶量、305天校正乳蛋白量和305天校正乳脂量表现为正的加性效应和正的显性效应，但是加性效应和显性效应均不显著(P > 0. 05)。表2STAT4基因内含子19突变基因型对中国荷斯坦牛乳质性状的影响
权利要求
1.一种STAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在序列表SEQ ID NO 1的第146bp处有一个G146-A146的碱基替换，序列表SEQ ID NO 1的第280bp处有一个G280-C280的碱基颠换。
2.根据权利要求I所述的TAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记，其特征在于扩增所述分子标记的引物对，其DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3.根据权利要求I所述的TAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记，其特征在于所述的分子标记在牛分子标记辅助育种中的应用。
4.根据权利要求2所述的TAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记，其特征在于所述的引物对在牛分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种STAT4基因作为牛乳质性状相关的分子标记及其应用，从牛STAT4基因中克隆获得一种作为分子标记应用的与牛乳质性状相关的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在SEQ ID NO1的146bp处有一个G146-A146的碱基替换，280bp处有一个G280-C280的碱基颠换。所发现的G146-A146的碱基替换和280bp处G280-C280的碱基颠换为2个单核苷酸连锁突变，因此这2个突变仅出现GGGG、GAGC和AACC这3种单倍型。本发明有益的效果公开了扩增STAT4基因部分内含子区所用的引物以及用于分子标记的检测方法。本发明为牛的标记辅助选择提供了2个新的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102660541SQ20121013411
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者姜俊芳, 宋雪梅, 张磊, 蒋永清 申请人:浙江省农业科学院