本发明涉及植物育种
技术领域：
，具体地，涉及一种甜叶菊四倍体的培育方法。
背景技术：
：甜叶菊为菊科宿根多年生草本植物，原产地在南美亚热带地区。甜叶菊的根、茎、叶中含有甜菊糖甙。甜菊糖甙具有高甜度（为蔗糖的200~300倍），低热量（仅为蔗糖的1/300）的特点，并有提高血糖、降低血压，促进新陈代谢的作用，对肥胖症、糖尿病、心脏病、龋齿等有一定的辅助作用，因而日益引起人们的关注和重视，成为继蔗糖、合成糖料后的“第三糖源”。多倍体育种是植物新品种培育的重要手段，多倍体育种起源于20世纪初，现在已广泛应用于植物新品种的培育中。多倍体由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点，药用活性成分含量增加，同时增强了多倍体植株的生态适应性和对逆境的抗逆性。目前，人工诱导多倍体的方法分为物理方法、生物技术方法和化学方法。物理方法是指采用物理方法如温度的激变、机械创伤、离心力、紫外线、渗透压改变等诱导产生多倍体植株，但这类方法存在嵌合率高，危险性较大，诱导率低等缺点，逐渐被淘汰。生物技术法是指通过细胞融合、远缘杂交等方法获得多倍体，该方法还处于探索阶段，技术还不够成熟，但应用前景非常广阔。化学诱导法分为原位诱导法和离体诱导法。其中，原位诱导法即把植物种子、生长的幼苗、茎尖在非离体条件下通过诱导剂处理，诱导染色体加倍的方法；离体诱导法是通过组织培养，在离体水平上诱导细胞内染色体加倍，从而获得多倍体植株的方法，该方法诱导率高、重复性强、实验条件易于控制、获得的多倍体嵌合率低等特点，具有较好的应用前景。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，甜叶菊的需求量也会越来越大，不仅应用于医药领域，也是人们钟爱的饮品。由于甜叶菊的药用和保健作用被广泛认识，甜叶菊的市场需求量大增，而甜叶菊的目前状况生产率较低，按照常规种植方法满足不了市场需求。结合多倍体诱导技术应用于甜叶菊的研究，现有技术鲜有报道，因此寻求一种操作简单、效果好的甜叶菊多倍体培养方法具有一定的经济意义和社会应用价值。技术实现要素：为解决现有技术中甜叶菊生产率低、常规生长满足不了市场需求的技术问题，本发明提供一种甜叶菊四倍体的培育方法，所述方法培育出的甜叶菊四倍体植株由于染色体的加倍，其药效成分显著增加，植株生长健壮，具有较广阔的应用前景。本发明解决技术问题采用如下技术方案：本发明涉及一种甜叶菊四倍体的培育方法，所述培育方法包括以下步骤：（1）选材：选取生长健壮长势良好的甜叶菊植株的种子；（2）种子处理：将甜叶菊种子，经清洗、消毒后将种子在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，使种胚萌发为绿色种胚原球茎；（3）诱导培养：将原球茎接种于添加有二甲基亚砜和秋水仙素的出芽诱导培养基上进行诱导一次培养3~5天，再转移到仅含秋水仙素的培养基上进行诱导二次培养4~6h，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基上进行培养15~20天，即得到所述甜叶菊四倍体植株。优选地，所述步骤（2）中清洗、消毒的步骤包括：将种子置于洗洁精浸泡15~20分钟，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中，于超声波条件下消毒10~20秒，最后用无菌水清洗3~5次。优选地，所述步骤（2）中无菌培养的步骤包括：将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，于25~30℃条件下，遮光培养7~10天，转为光照培养25~30天。优选地，所述步骤（3）中二甲基亚砜在培养基中含量为3%~5%。优选地，所述步骤（3）中秋水仙素的质量分数为0.02%~0.2%。优选地，所述步骤（3）中第一次诱导培养的培养基配方MS+6-BA0.2~0.6mg/L+TDZ0.3~0.8mg/L，培养温度25~28℃，光照强度2500~3000Lux；第二次诱导培养基配方均为MS+6-BA0.2~0.6mg/L+TDZ0.3~0.8mg/L，培养温度15~18℃，遮光培养。优选地，所述步骤（3）中不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基配方为MS+6-BA0.2~0.4mg/L+TDZ0.3~0.6mg/L，培养温度25~28℃，光照强度2500~3000Lux。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明所述的甜叶菊四倍体的培育方法，培育出的甜叶菊四倍体植株由于染色体的加倍，使得甜叶菊具有较高的药用成分，能大大提高甜叶菊糖苷的产率，且培育出的多倍体植株，生长健壮。此外，所述培育方法比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产，具有较广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：本实施例涉及一种甜叶菊四倍体的培育方法，所述培育方法包括以下步骤：（1）选材：选取生长健壮长势良好的甜叶菊植株的种子；（2）种子处理：将甜叶菊种子置于洗洁精浸泡15分钟，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中，于超声波条件下消毒15秒，最后用无菌水清洗3次；经清洗、消毒后将种子在无菌培养基皿内剪开，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，于25~30℃条件下，遮光培养10天，转为光照培养28天进行无菌培养，使种胚萌发为绿色种胚原球茎；（3）诱导培养：将原球茎接种于添加培养基中含量为3%二甲基亚砜和质量分数为0.1%秋水仙素的诱导培养基上进行诱导一次培养3天，再转移到仅含秋水仙素的培养基上进行诱导二次培养5h，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基上进行培养20天，即得到所述甜叶菊四倍体植株。其中，第一次诱导培养的培养基配方MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培养温度28℃，光照强度2500~3000Lux；第二次诱导培养基配方均为MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培养温度16℃，遮光培养；不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基配方为MS+6-BA0.3mg/L+TDZ0.5mg/L，培养温度25~28℃，光照强度2500~3000Lux。取培养得到的甜叶菊植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例2：本发明涉及一种甜叶菊四倍体的培育方法，所述培育方法包括以下步骤：（1）选材：选取生长健壮长势良好的甜叶菊植株的种子；（2）种子处理：将甜叶菊种子置于洗洁精浸泡15分钟，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中，于超声波条件下消毒20秒，最后用无菌水清洗5次；经清洗、消毒后将种子在无菌培养基皿内剪开，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，于25℃条件下，遮光培养7天，转为光照培养30天进行无菌培养，使种胚萌发为绿色种胚原球茎；（3）诱导培养：将原球茎接种于添加培养基中含量为3%二甲基亚砜和质量分数为0.02%秋水仙素的诱导培养基上进行诱导一次培养5天，再转移到仅含秋水仙素的培养基上进行诱导二次培养6h，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基上进行培养15天，即得到所述甜叶菊四倍体植株。其中，第一次诱导培养的培养基配方MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培养温度25℃，光照强度2500~3000Lux；第二次诱导培养基配方均为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培养温度15℃，遮光培养；不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基配方为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培养温度25℃，光照强度2500~3000Lux。取培养得到的甜叶菊植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例3：本发明涉及一种甜叶菊四倍体的培育方法，所述培育方法包括以下步骤：（1）选材：选取生长健壮长势良好的甜叶菊植株的种子；（2）种子处理：将甜叶菊种子置于洗洁精浸泡20分钟，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中，于超声波条件下消毒10秒，最后用无菌水清洗5次；经清洗、消毒后将种子在无菌培养基皿内剪开，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，于30℃条件下，遮光培养10天，转为光照培养25天进行无菌培养，使种胚萌发为绿色种胚原球茎；（3）诱导培养：将原球茎接种于添加培养基中含量为5%二甲基亚砜和质量分数为0.2%秋水仙素的诱导培养基上进行诱导一次培养3天，再转移到仅含秋水仙素的培养基上进行诱导二次培养4h，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基上进行培养20天，即得到所述甜叶菊四倍体植株。其中，第一次诱导培养的培养基配方MS+6-BA0.6mg/L+TDZ0.8mg/L，培养温度28℃，光照强度2500~3000Lux；第二次诱导培养基配方均为MS+6-BA0.6mg/L+TDZ0.8mg/L，培养温度18℃，遮光培养；不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基配方为MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培养温度28℃，光照强度2500~3000Lux。取培养得到的甜叶菊植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍体。将上述培育制得的四倍体甜叶菊植株，按照常规方法制成甜叶菊粗粉，并取50g粗粉进行甜叶菊糖苷提取，最后获得甜叶菊糖苷的收率见下表。多糖含量/%实施例120.35实施例219.93实施例320.08对比例111.72其中，对比例1为从常规甜叶菊植株上选取甜叶菊叶，经粉碎后得到的甜叶菊粗粉。通过上述对比，可以很清楚的判定本发明所述的方法所培育出的甜叶菊中糖苷含量明显高于常规甜叶菊植株中糖苷的含量，本发明具有较好的应用前景。采用本发明所述的甜叶菊四倍体的培育方法，培育出的甜叶菊四倍体植株由于染色体的加倍，使得甜叶菊具有较高的药用成分，能大大提高甜叶菊糖苷的产率，且培育出的多倍体植株，生长健壮。此外，所述培育方法比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产，具有较广阔的应用前景。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3