本发明涉及植物生物工程组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法。
背景技术：
“胚状体”也叫做“体细胞胚”或“体胚”，以区别于“合子胚”，是由愈伤组织中的部分薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接再分化形成具有胚的功能的结构。“胚状体”在生产实践上可以直接用于制造人工种子和生产再生植株(试管苗)；在理论研究上，是探索细胞分化、器官建成、个体发育及其相关的解剖学和生理生化变化过程的重要材料。因此，如何获得胚状体是植物学界关心的热门技术领域之一。
但是，国内有关烟草组培技术的资料不多，特别是烟草胚状体诱导技术的研究报告更少。具有代表性的有：王瑞库等人研究发表的影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-铁盐、蔗糖和腺素及影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-氨基酸和激素。司龙亭等人研究发表的烟草人工种子研究进展初报。贾勇炯等人研究发表的在烟草花药培养中诱导胚状体发生的研究。潘莉等人研究发表了烟草未授粉子房单倍体诱导及影响因素的研究。王连华等人研究发表了烤烟K326人工种子悬浮培养条件下体细胞胚胎的发生研究。慕平利等人研究发表了烟草叶片直接再生-基因转化体系的建立。周田等人研究发表了钾高效烤烟杂交品种花药培养研究。现有诱导烟草胚状体的资料，已经分别涉及到MS,H,Nitsch,等不同的基本培养基、不同基因型的栽培品种、不同器官作外植体和固体或液体悬浮等不同的培养方法。但是，就其重要的研究结果而言，可归纳为以下两点：1、适量的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)对烟草胚状体的发生必不可少。增加铁盐、腺素(即腺嘌呤)、KT(激动素)、IAA(吲哚乙酸)和谷氨酰胺等，有利烟草胚状体的发生和发育。由此可见，烟草胚状体的诱导培养基都是由多种诱导剂成分复合配制而成，程序发杂，尚未见用单一诱导剂成功诱导烟草胚状体的报导。2、现有传统技术对烟草胚状体的诱导周期长，效率低。而且原始外植体都要反复转接到新培养基(以减轻2,4-D的毒副作用)进行继代培养，甚至多达5-6代的培养，长达3-4个月才能发生胚状体。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，以同时具有细胞分裂素和生长素生物活性的灵发素作诱导剂制备的诱导培养基，比传统的培养基诱导烟草胚状体形成速度快、产量高、质量好，且原始外植体无需转瓶进行继代培养，即可直接实现烟草胚状体的生产。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，以灵发素作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基为配方为：MS+灵发素3.0-5.0mg/L，pH为5.8～6.0。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下切成方片，即得烟草叶片外植体，备用。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，将所述烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养25天，获得烟草胚状体。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基中灵发素的浓度为4.5mg/L。
本发明至少包括以下有益效果：
1)灵发素同时具有细胞分裂素(Cytokinin)和生长素(Auxin)两类植物生长物质的生物活性，本发明采用灵发素添加于MS配制成单一的诱导培养基，排除了传统技术认为必不可少，却又有明显毒副作用的2,4-D，有利人们竖立研究烟草胚状体的新观念；
2)本发明的诱导培养基以灵发素作为唯一的诱导剂，针对双子叶植物烟草的特殊生物学特性，在大量筛选试验的基础上，确定了灵发素的适宜浓度，使得烟草叶片外植体在诱导培养基作用下进行脱分化形成愈伤组织之后直接再分化，高效优质地形成烟草胚状体，本发明的诱导培养基比传统的培养基诱导效果更好，烟草胚状体形成速度更快，25d即可发生，比传统技术快2-3倍，胚状体的产量和质量亦显著提高。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素3.0mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，在无菌条件下，将烟草叶片切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草外叶片植体接入步骤一的诱导培养基中，培养25天。
实施例2：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素4.5mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草外叶片植体接入步骤一的诱导培养基中，培养25天。
无菌烟草植株长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，相比其他烟草叶片，作为外植体培养更易发生脱分化、再分化形成胚状体。
实施例3：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素5.0mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作为外植体，备用，需要说明的是，前述的沿主脉分切是指弃用了叶片两侧靠边缘的叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草外叶片植体接入步骤一的诱导培养基中，培养25天。
无菌烟草植株长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，在切除叶片的上下两端以及在沿主脉两边切取5mm×5mm的方片的同时也切除了叶片左右两侧边缘的叶片部分，这种操作有利保证所用的烟草叶片外植体从外部形态到内在代谢水平都更为均匀一致，能有效减少实验结果的材料误差。
对比例1：
为了说明本发明的用灵发素诱导烟草胚状体的方法的效果，本发明的发明人以实施例3的方法，将诱导培养基中的灵发素浓度依次设定为5组：3.0mg/L、3.5mg/L、4.0mg/L、4.5mg/L、5.0mg/L，并以参考王连华，等(2002)和慕平利，等(2005)的研究结果拟定的类似于传统方法的诱导培养基为对照组(CK)，其配方为：MS+2,4-D 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L+KT0.1mg/L。在上述四组中每组接种5瓶，每瓶接种3个外植体方片。在常规条件下诱导培养烟草胚状体，并统计不同试验组培养10天的平均出愈率和培养25天的胚状体发生率、转绿自养率、肉眼可辨体胚数/方片，以及首胚出现天数，结果见表1。
其中：
平均出愈率(％)＝出愈方片数/接种方片数×100％，不论方片污染与否及出愈多少；
首胚出现天数：每天定时观察1次，记录出现首个肉眼(借助放大镜)可辨胚状体所需天数；
培养25d终止试验，在上述5组中每组随机取3瓶无污染者，统计：胚状体发生率(％)＝出胚状体方片数/接种方片数×100％；肉眼可辨胚状体数/方片；转绿自养率(％)＝转绿胚状体数/胚状体数/方片×100％。均不考虑胚状体的具体形态。所有指标均记录3瓶的平均值。
表1.用灵发素诱导烟草胚状体的实施案例及与传统技术的效果对比
注：表中案例6(CK)的配方是参考王连华，等(2002)和慕平利，等(2005)的研究结果拟定。
转绿自养％率被视为评价胚状体质量的重要指标之一。
通过表1中各案例的对比可见，用灵发素作为单一诱导剂配制的烟草胚状体诱导培养基，其效果全面优于由2,4-D，IAA和KT三种植物生长物质复配成的传统诱导培养基，不仅胚状体发生快，而且产量高、质量好。这种优良效果至少与其彻底摆脱了2,4-D的毒副作用有关。在综合考虑成本与收益的情况下，灵发素浓度以4.5mg/L最为适宜。本发明所建立的用灵发素(LFS)诱导烟草胚状体的技术体系，有利改变“适量的2,4-D对烟草胚状体的发生必不可少”这一传统观念。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。