影响烟草色素含量的NtWRKY69基因及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一个影响烟草色素含量的ntwrky69基因及其应用的专利申请。

背景技术：

烟草是双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(nicotiana)有60多个种，其中2个栽培种中的普通烟草(又称红花烟草，nicotianatabacum)占据主要面积，黄花烟草(nicotianarustica)的面积很小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。

作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。

植物色素是烟草中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中会大量降解消失，其主要降解方式有两种：一种方式是叶绿素由噗啉环降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香；另一种方式是叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，转化成烟叶的清甜成分。一般而言，叶绿素充分降解后对烟质有利，但如果不能降解完全，在干烟叶中，叶绿素就会变成一种不利的化学成分，进而使烟叶带有明显青杂气。如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，而且对于烟叶质量影响十分明显；因而叶绿素是否降解充分是烟叶分级中被严格控制的指标之一。烟叶中的黄色素主要是类胡萝卜素，烟叶中的类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质呈正相关关系。烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。

由于烟叶中色素类物质与烟叶品质、烟叶质量关系十分紧密，因而对烟叶色素有关基因的充分和深入研究，从而对色素类物质进行有针对性调控，对于烟叶品质改善和烟叶品种改良具有十分重要的理论和应用意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一个影响烟草色素含量的ntwrky69基因，从而能够对烟草中色素类物质含量有所调控，进而为烟草质量改善奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个影响烟草色素含量的ntwrky69基因，包括918bp碱基，其碱基序列如seqidno.1所示；其中第80-600位核苷酸是其特异性核心片段。

影响烟草色素含量的ntwrky69基因所编码蛋白，包括305个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述影响烟草色素含量的ntwrky69基因在烟草中的应用，该基因与烟草色素含量高度相关，将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量明显降低。

用于沉默影响烟草色素含量ntwrky69基因的rnai载体trv2-ntwrky69，构建方法为：以ntwrky69基因中第80-600位核苷酸作为vigs的引导序列，将此核酸片段插入trv2载体中，构建获得trv2-ntwrky69载体。

所述用于沉默影响烟草色素含量ntwrky69基因的rnai载体trv2-ntwrky69在植物中的应用，用于沉默ntwrky69基因，进而下调植物中色素类物质表达量。

利用所述用于沉默影响烟草色素含量ntwrky69基因的rnai载体trv2-ntwrky69所构建的ntwrky69基因沉默植物新品种的培育方法，具体方法为：

通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术等干扰、沉默、敲除ntwrky69基因，可获得色素含量变化的烟草转化植株新品种（也可采用其他载体以对ntwrky69基因进行超量表达，构建ntwrky69基因超表达转基因植物新品种）；具体而言：

利用农杆菌介导的转化方法，将rnai载体trv2-ntwrky69转化植株，通过筛选、鉴定获得ntwrky69基因沉默植株，所述ntwrky69基因沉默植株其表型为，基因沉默的转基因植株中色素类物质含量比正常植株明显下降。

本申请中，通过对烟草ntwrky69基因的克隆、对应蛋白的分析，发明人发现该基因在烟草色素合成途径调控上具有重要的用途，与植物叶片中色素类物质含量高度相关。进一步通过病毒介导的基因沉默技术，发明人发现在将ntwrky69基因沉默后，新的转基因植株中的色素类物质含量明显降低。利用这一特性，可为烟草的基因工程育种或其他植物新品种培育提供新的策略和路径。

附图说明

图1为与对照植株相比ntwrky69基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导ntwrky69基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要色素含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。

生物材料：

烟草材料，栽培烟草（nicotianatabacum）k326品种，购买于玉溪中烟种子有限责任公司；

本氏烟（nicotianabenthamiana），种子由中国农业科学院烟草研究所馈赠；

沉默烟草基因所用到的载体质粒trv2-lic、trv1、trv2、trv2-pds载体等，购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；

基因测序及引物合成由上海生工生物工程有限公司提供完成；

实验试剂：

限制性内切酶、datp、dttp、primerstargxldnapolymerase、dna凝胶回收试剂盒minibestagarosegeldnaextractionkit、质粒dna小量纯化试剂盒minibestplasmidpurificationkit、乙酰丁香酮等，均为takara生物技术有限公司产品；

t4dnapolymerase、rna提取trizol试剂等，为invitrogen公司产品；

反转录试剂盒，roche公司产品；

dnaase酶，fermentas公司产品；

mes，sigma公司产品；卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司；

部分试剂配方及配制方法简要说明如下：

（1）lb液体培养基（1l）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化钠（nacl），5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；

（2）1m2-(n-吗啉)乙磺酸（mes）储备液：ddh2o溶解mes，过滤灭菌，-20℃储存备用；

（3）200mm乙酰丁香酮（acetosyringone）储备液：无水乙醇溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；

实验仪器：

梯度pcr仪mastercyclerepgradient（用于克隆目的基因片段），德国eppendorf公司产品。

实施例1

本实施例主要就影响烟草色素含量的ntwrky69基因的获得过程，简要介绍如下。

（1）烟草rna提取及cdna合成

rna提取，具体可参考如下步骤：

以生长4周大小的栽培烟草k326幼嫩叶片为样品，经液氮充分研磨成粉状后，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0ml的trizol试剂的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿；振荡混匀，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中；加入500μl异丙醇，沉淀、离心分离出rna，再经75%酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的rnasefree的水，充分溶解；

对所提取总rna进行dnasei处理，10μl的消化反应体系设计如下：

所提取rna，1μg；

10×reactionbufferwithmgcl2，1μl；

dnasei,rnase-free，1μl（1u）；

depc-treatedwater加至10μl；

37℃水浴中放置30min。

对上述dnasei处理后rna提取物进行cdna反转录，具体可参考如下操作步骤。

第一链合成：在无菌的0.2ml离心管中配置下列模板rna/引物混合液（7μl体系）：

模板rna(100ng/μl)，1μl；

oligo(dt)primer(50μm)，1μl；

rnasefreedh2o，5μl；

70℃保温10min后，迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒钟使模板rna/引物的变性溶液聚集于离心管底部；

在上述离心管中配置如下10μl反转录反应液体系：

上述模板rna/引物变性溶液，7μl；

5×m-mlvbuffer，2μl；

dntp(mixture，各10mm)，0.5μl；

rnaseinhibitor（40u/μl），0.25μl；

rtasem-mlv(rnaseh-)(200u/μl)，0.25μl；

42℃保温1h；70℃保温15min，然后冰上冷却，所得cdna用于后续pcr扩增。

（2）pcr扩增获得ntwrky69基因

设计用于pcr扩增获得ntwrky69基因全长的引物序列如下：

ntwrky69-f:5'-atggatggaagattcaata-3'，

ntwrky69-r:5'-tcagcccgtggtcccacacc-3'；

以上述步骤（1）中所制备cdna为模板，50μl扩增体系设计如下：

gxlpolymerase，1μl；

cdna，1μl；

5×gxlbuffer，10μl；

dntpmixture(10mm)，4μl；

primer-f/r，8μl；

ddh2o，26μl；

pcr反应程序为：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、1min；40个循环。

对pcr扩增产物进行回收、纯化后，测序获得影响烟草色素含量的ntwrky69基因序列，其碱基序列如seqidno.1所示，包括918bp碱基，其中第80-600位核苷酸是其特异性核心片段。

对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如seqidno.2所示，包括305个氨基酸。

实施例2

利用实施例1中所获得影响烟草色素含量的ntwrky69基因，发明人进一步构建了基因沉默用rnai干涉载体trv2-ntwrky69，相关构建过程简要介绍如下。

选择此基因中较特异的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）为vigs的引导序列，设计引物获得此序列。然后将此核酸片段插入vigs载体中，构建trv2-ntwrky69载体，具体构建过程为：

（1）获得目的片段，选择此基因中较特异的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）为vigs的引导序列，设计引物并以实施1所获得的基因全长为模板进行pcr扩增，获得目的基因片段，引物序列设计如下：

ntwrky69-vi-f：5’-cgacgacaagaccctcgccgcgttccgacatgtt-3’，

ntwrky69-vi-r：5’-gaggagaagagccctcgattgacttgcgaaattgc-3’；

ntwrky69-vi-f引物5’端部分序列“cgacgacaagaccct”与ntwrky69-vi-r引物5’端部分序列“gaggagaagagccct”为trv2-lic载体的接头序列；

pcr扩增片段长度：520bp。

（2）构建trv2-ntwrky69载体，先用限制性内切酶psti将trv2-lic质粒进行单酶切并回收酶切产物，然后用t4dna聚合酶分别对trv2-lic的单酶切产物片段与步骤（1）中所得目的片段（即ntwrky69基因特异片段）进行连接处理；

10μl连接体系设计如下：

t4dna聚合酶，1μl；

10xt4dna聚合酶buffer，1μl；

trv2-lic单酶切片段（或ntwrky69基因特异片段），7μl；

dttp，1μl；

22℃连接30min，随后70℃、20min；

随后将上述分别处理后的trv2-lic质粒载体片段和基因片段充分混匀，65℃、2min，再22℃、10min保温处理；

将此连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，在含有卡那霉素（50mg/l）的lb培养基上涂布，37℃过夜倒置培养形成单菌落，对单菌落检测，获得构建正确的trv2-ntwrky69重组载体。

为对植株中ntwrky69基因沉默，一般而言，需要将trv2-ntwrky69重组载体转化农杆菌，进一步利用农杆菌介导的基因转化方法，将trv2-ntwrky69重组载体整合进植株基因组中，从而实现对目的基因ntwrky69基因的沉默。

将trv2-ntwrky69重组载体转化农杆菌后，一般尚需进一步筛选、鉴定以获得用于转化的工程菌，具体操作过程参考如下：

将trv2-ntwrky69转化gv3301农杆菌感受态细胞后，涂布在lb平板（含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平）上，28℃倒置黑暗培养2~3天，挑取单菌落，并利用菌落pcr筛选携带ntwrky69基因片段的农杆菌单克隆；10μl的菌落pcr扩增检测体系设计如下：

gxlpolymerase，0.2μl；

5×gxlbuffer，2μl；

dntpmixture(10mm)，0.8μl；

primer-f/r（实施例1中ntwrky69-f/r引物），1.6μl；

ddh2o，5.2μl；

菌落，0.2μl；

pcr反应程序：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、30sec，35个循环。

实施例3

利用实施例2所构建的含有vigs沉默载体trv2-ntwrky69的工程菌，以本氏烟草为例，发明人进一步进行了栽培试验，以沉默植物体内影响烟草色素含量的ntwrky69基因，相关实验过程简要介绍如下。

（1）将烟草种子播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，于22℃，16h光照/8h黑暗条件下进行日常肥水管理等；生长4周，选取长势一致幼苗分组备用；

（2）将含有trv1、trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds农杆菌单菌落（其他质粒构建过程参考前述构建过程即可）接入5ml的lb培养基中(含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平)，28℃、180r/min过夜振荡培养至od600约为1.0；

将生长起来的菌液接种到30ml的lb液体培养基中继续培养，28℃过夜振荡培养至od约为2.0；

3900r/min离心15min收集农杆菌到50ml离心管中，弃上清，向各菌体中加入注射缓冲液（10mm的mes，10mm的mgcl2，250μm的乙酰丁香酮），调od值约为1.0，室温放置3-6小时，再向trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds悬浮液中等体积加入trv1悬浮液，混匀；

（3）挑选长势一致，约4-5片叶子的烟草植株，用1ml无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同trv重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22℃，75%空气湿度中培养；

接种2周后，采集新生叶片提取rna，利用实时pcr检测基因沉默效率，同时取材利用高效液相色谱法测量烟草叶片色素类物质含量。

分析结果表明，病毒诱导沉默的trv2-ntwrky69植株中ntwrky69基因的表达水平仅为对照的10%左右（结果如图1所示），说明沉默效果显著。trv2-ntwrky69植株中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素双含量与对照植株相比显著下降（图2和下表所示），说明ntwrky69基因与烟草色素含量相关。

ntwrky69沉默烟草植株色素含量测定（对照样品表示空白载体对照）：

。

综合上述结果可以看出，ntwrky69基因与植物烟叶色素含量高度相关，通过沉默ntwrky69基因，可明显调整烟叶中的色素含量，进而可为烟草改良或其他植物新品种培育奠定基础。

sequencelisting

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>影响烟草色素含量的ntwrky69基因及其应用

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tgggcatggaggaaatatggacaaaaacccatcaaaggctctccctatcctaggggatat300

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