水稻雄性不育基因OsFIGNL1及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻雄性不育基因osfignl1及其应用。

背景技术：

植物雄性不育多表现为雌蕊发育正常，雄配子败育不能行使正常功能。水稻雄性不育材料在水稻杂种优势的利用和杂交水稻的培育中具有重大的应用价值，大部分的雄性不育材料是由隐性核基因的突变导致，其不育性不受环境影响，且遗传稳定；且其中绝大多数受单基因控制。水稻隐性核不育基因的克隆及其表达调控的功能研究有助于我们对水稻雄性生殖发育过程的深入理解，还可为新型不育系材料的培育、新型杂种优势利用途径的创制奠定理论基础和提供基因资源。

水稻的雄性生殖器官包含6枚雄蕊及其支撑结构－－花丝。水稻雄蕊的发育涉及减数分裂、有丝分裂、绒毡层的发育和降解以及花粉囊壁各类物质的合成与转运，需要大量特异基因和非特异基因协调参与调控。雄配子在雄性生殖器官－－花药中发育成熟，而水稻花药发育导致的败育主要表现为绒毡层发育和降解异常，花粉母细胞减数分裂过程染色体分裂行为异常和小孢子发育过程中花粉囊壁的合成缺陷等。这些复杂而有序的生物学过程最终决定了高等开花植物花粉的育性。水稻花药的发育涉及众多基因的网络调控，任何关键基因的突变均可导致花粉败育，从而导致植株不育。而水稻花药发育相关突变体是研究细胞分裂、分化和不育分子机理较为理想的材料，对其进行的相关发育过程的表型分析及其突变基因的图位克隆有助于人们对花药发育与雄性不育的分子机理进一步深入研究，也可为未来新型杂种优势的利用途径提供基因资源和理论依据。

水稻花药发育过程中，雄配子的减数分裂在花药发育的早期进行。在花药发育的减数分裂阶段，dna复制一次，随后细胞进行两次分裂，形成染色体数目减少一半的四分体小孢子；小孢子发育经过两次有丝分裂形成成熟花粉粒，成熟花粉粒的两个精细胞通过受精作用产生二倍体的孢子，从而保持物种染色体数的恒定。减数分裂的同源染色体发生交换、重组，使配子的遗传多样化。这个过程如果出现缺陷，会使小孢子发育异常，最后影响植株的育性。

fidgetin是第一个在哺乳动物中发现的aaa蛋白，从而使人们对aaa蛋白在哺乳动物胚胎发育中的作用有了新的认识。小鼠fidgetin基因突变导致小鼠眼睛变小，细胞周期延迟，视网膜上皮细胞发育缓慢等发育障碍。fidegtin编码减数分裂家族aaa(atpasesassociatedwithdiversecellularactivities)蛋白。蛋白质序列比对和系统发育树分析表明，fidgetin属于aaa蛋白的第七亚家族成员即aaa减数分裂家族成员。目前，对fidgetin以及直系蛋白的功能研究较少。fidgetin参与微管切割以及微管末端的解聚，在有丝分裂纺锤体的结构中起作用。在小鼠中，根据序列同源性人们已经鉴定了与fidgetin同源的两个基因，fidgetin-like1(fignl1)和fidgetin-like2(fignl2)。fidgetin-like1抑制成纤维细胞生长因子，调控成骨细胞的增殖和分化。研究表明小鼠fidgetin-like1在细胞核和细胞质中均表达，在减数分裂中起重要作用。对线虫fignl1的aaa结构域晶体结构研究发现，线虫fignl1的aaa结构域可以形成六聚体的环形结构并具有很高的atpase活性。线虫fidgetin-like1定位于细胞核，酵母双杂和pulldown实验证明fidgetin-like1与ubiquitin-likemodifier(smo-1)相互作用。fidgetin-like1和smo-1的相互结合在线虫的发育过程中具有重要作用。fidgetin-like1和smo-1的单突变体都会导致线虫性腺形成缺陷和不育表型。拟南芥atfignl1基因的突变后导致在全基因组水平上染色体的交换频率增加。研究报道人类fignl1基因是同源重组体细胞dna修复所必须。

在水稻中，osfignl1基因的相关研究迄今尚未见报道。分离克隆水稻osfignl1基因，探讨osfignl1基因突变导致水稻雄性不育的原因，阐明水稻雄性不育突变体雄配子败育的分子机制，将进一步深化人们对雄性不育分子机理的认识。同时，将雄性不育基因应用于水稻品种的改良，对育种工作者具有重要的实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供水稻雄性不育基因osfignl1及其编码的蛋白。

本发明的另一目的是提供水稻雄性不育基因osfignl1在水稻品种改良中的应用。

为了实现本发明目的，本发明在通过⁶⁰co-γ诱变获得的遗传稳定的雄性不育突变体(水稻雄性不育突变体fignl1)中，图位克隆获得一个水稻雄性不育基因osfignl1，基因osfignl1为：

i)seqidno：1所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

基因osfignl1的cdna序列如seqidno：2所示。

本发明的基因osfignl1及其cdna序列亦可通过人工合成的方式得到。

当seqidno：1所示序列的第2467位碱基为a，或seqidno：2所示序列的第515位碱基为a时，基因osfignl1编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno：3所示。

当seqidno：1所示序列的第2467位碱基缺失，或seqidno：2所示序列的第515位碱基缺失时，基因osfignl1编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示。

本发明还提供表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含所述基因osfignl1的核酸序列。

本发明还提供含有所述基因osfignl1、或者所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌、转基因细胞系。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本发明还提供所述基因osfignl1在水稻品种改良中的应用。

本发明还提供所述基因osfignl1在水稻杂种优势培育新品种中的应用。

本发明还提供所述基因osfignl1在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供用于扩增所述基因osfignl1的特异性pcr引物对，所述引物对的上、下游引物序列分别如seqidno：5、6所示。

本发明还提供用于扩增所述基因osfignl1cdna序列的特异性pcr引物对，所述引物对的上、下游引物序列分别如seqidno：7、8所示。

本发明进一步提供可用于包括启动子、外显子、内含子以及终止子的osfignl1全长基因组dnapcr扩增及表达载体构建的引物对，所述引物对的上、下游引物序列分别如seqidno：9、10所示。

本发明首次成功克隆出一个水稻雄性不育基因osfignl1。通过⁶⁰co-γ诱变获得一个osfignl1功能缺失突变体，该突变体在大田种植环境中表现出植株营养生长正常，植株雄性不育，花粉100％碘败，雌配子发育不受影响。减数分裂压片显示，由于osfignl1功能缺失严重影响了减数分裂过程中染色体的行为，最终导致小孢子发育缺陷。该突变体可应用于水稻杂种优势新品种的培育。基因osfignl1今后可作为一个水稻减数分裂调控的功能基因应用于水稻杂种优势创制工作中，具有巨大的开发利用价值，市场应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型中恢8015和突变体fignl1主要表型鉴定结果；其中，a为抽穗后的野生型中恢8015植株和突变体fignl1植株，b为成熟期，野生型中恢8015的稻穗和突变体fignl1稻穗，c为去掉内外稃，野生型中恢8015的小花，d为去掉内外稃，突变体fignl1的小花，e为野生型中恢8015的成熟花粉，f为突变体fignl1的成熟花粉。

图2为本发明实施例2中野生型中恢8015和突变体fignl1花药发育过程半薄切片观察结果；其中，中恢8015：a、b、c、d、i、j、k，fignl1突变体：e、f、g、h、l、m、n。a、e：小孢子母细胞减数分裂时期，b、f：四分体时期，c、g：单核期，d、h：小孢子液泡化时期，i、l：二孢花粉时期，j、m：成熟花粉时期，k、n：花药开裂时期。e：表皮，en：内壁，t：绒毡层，msp：小孢子，ms：小孢子母细胞，st：药隔，mp：成熟花粉，dp：缺陷花粉。

图3为本发明实施例3中野生型中恢8015和突变体fignl1成熟花药扫描电镜观察结果；其中，a为野生型成熟花药，b为野生型中恢8015成熟花药粒，c为野生型中恢8015花药表皮，d为野生型中恢8015花药内壁，e为野生型中恢8015花粉外壁，f为突变体fignl1成熟花药，g为突变体fignl1成熟花粉粒，h为突变体fignl1花药表皮，i为突变体fignl1花药内壁，j为突变体fignl1花粉外壁。

图4为本发明实施例4中野生型中恢8015雄配子减数分裂染色体观察结果；其中，a为细线期，b为偶线期，c为粗线期，d为双线期，e为终变期，f为中期i，g为后期i，h为二分体，i为末期ii，j为四分体。

图5为本发明实施例4中fignl1突变体雄配子减数分裂染色体观察结果；其中，a为细线期，b为偶线期，c为粗线期，d、e为双线期，可见染色体桥，箭头所示，f、g为终变期，可见缠绕的染色体和染色体桥，箭头所示，h、i为中期i，可见染色体桥，箭头所示染色体不能排列在赤道板，j、k为后期i，箭头所示黏着染色体和染色体碎片，l为中期ii，m为后期ii，n为末期ii，o为四分体时期，中期ii(l)到四分体(o)，可见落后染色体，箭头所示。

图6为本发明实施例5中野生型中恢8015及突变体osfignl1基因序列比对结果。

图7为本发明实施例6中转基因互补材料表型鉴定结果；其中，a为野生型中恢8015成熟穗子(左)转基因互补植株的成熟穗子(右)，b为去掉内外稃，野生型中恢8015植株小花(左)、互补植株小花(中)和突变体fignl1植株小花(右)，c为野生型中恢8015花粉粒，d为互补植株花粉粒，e为突变体fignl1植株花粉粒。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用方法为常规方法；所用引物均由invitrogen公司合成；测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行；各种dna限制性内切酶购于thermoscientific公司；dna纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于promega公司，逆转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司，使用方法参照说明书。

本发明中涉及的水稻雄性不育突变体fignl1现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctccno：p201710，保藏日期2017年5月17日。

实施例1水稻雄性不育突变体fignl1表型鉴定

水稻雄性不育突变体fignl1是经⁶⁰co-γ辐射籼稻品种中恢8015(zh8015)得到不育突变体。fignl1突变体在营养生长阶段与野生型无明显差异，在株高、分蘖等株型性状均无任何异常。在生殖生长阶段，野生型小花和突变体小花的内外稃、雌蕊、桨片并无明显差异。然而，野生型中恢8015成熟花药肥大，花药呈黄色、饱满充实，与野生型相比，突变体fignl1的花药瘦小，略黄、抽穗后用1％i2-ki对成熟花粉进行染色，可观察到突变体的花粉未染上颜色，形态不规则，观察不同视野的花粉粒，发现突变体花粉呈现完全碘败，而野生型花粉染色正常。至水稻成熟期，野生型植株正常结籽，而突变体植株不结实(图1a～f)。

实施例2fignl1突变体花药发育过程半薄切片观察

取大田生长的水稻fignl1突变体及野生型不同发育时期的穗子，较大的穗子用剪刀剪开一个小口，有利于渗透液的渗入。样品于50％faa固定液(50％乙醇∶甲醛∶冰乙酸＝90∶5∶5)中固定，用真空泵缓慢抽气30分钟，样品沉到瓶底，更换新配置的50％faa固定液，室温放置16-24小时。在faa固定液中，样品可以保存三个月之久。若要长期保存，可将固定液换成70％乙醇室温保存。根据颖花长度，将材料分别保存。在70％酒精中用镊子去掉颖花的内外稃，存放于青霉素小瓶中。酒精梯度脱水：50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇，室温下每级60分钟。100％饱和番红中浸泡2个小时。经梯度酒精脱水后放入树脂渗透液中室温1-2小时，之后于树脂渗透液中4℃过夜渗透。将样品放入包埋板中，花药一端朝向包埋盒两端，在包埋板中加入聚合液，要求5分钟之内操作完成，以免聚合液凝固。放入65℃烤片机中2小时，稍微凝固后放入37℃烘箱中，聚合3-4天，直到包埋块变硬。用刀片将含有花药的包埋块修块，修块尽量小，用leicarm2265全自动超薄切片机横切花药，切片厚度2m。在载玻片上滴加少许蒸馏水，将切片材料在蒸馏水中展片，等完全展片后，吸走蒸馏水，将载玻片放到烤片机上烘干。在烘干的载玻片上加入甲苯胺蓝染色30分钟，在载玻片样品的背面水洗晾干，即可用普通显微镜拍照观察。野生型中恢8015和fignl1突变体不同发育时期花药半薄切片分析表明：在小孢子母细胞时期，在形态上，野生型中恢8015和fignl1突变体的花药壁从外到内，依次为外层、内层、中间层、绒毡层无明显差异，囊腔充满处于减数分裂的花粉母细胞也无明显差异。fignl1突变体绒毡层在小孢子大液泡后期发育不正常，降解速度缓慢。小孢子在大液泡时期形态开始发生异常，在成熟花药中，花药的内壁残存一层没有任何填充物绒毡层细胞，绒毡层并没有完全降解，在药室内出现畸形和严重变形的小孢子(图2a～n)。

实施例3fignl1突变体成熟花药扫描电镜观察

将野生型中恢8015和fignl1突变体成熟花药放置于2.5％的戊二醛中，缓慢抽真空，直到样品沉入管底，4℃冰箱固定过夜，第二天早晨如下步骤操作：将固定液倒掉，花药样品用磷酸缓冲液(0.1m，ph7.0)洗涤三次，每次20分钟；用1％饿酸溶液固定样品1.5小时，花药样品染成黑色；倒掉饿酸废液，花药样品用磷酸缓冲液(0.1m，ph7.0)洗涤三次，每次20分钟；对样品进行脱水处理，经过梯度30％、50％、70％、80％、90％和95％酒精分别脱水10-15分钟后，再用100％乙醇处理2次，每次20分钟；用乙酸异戊酯处理样品过夜，c02临界点干燥，镀膜后，样品在(tm-1000hitachi)型扫描电镜下观察、照相并记录结果。扫描电镜结果显示：野生型中恢8015花药能够形成正常的圆形花粉粒，可见萌发孔，与野生型中恢8015成熟花粉相比，fignl1突变体的花粉呈现皱缩、塌陷的形态，突变体花药外壁更致密。野生型中恢8015花药内壁覆盖着大量乌氏体，而fignl1突变体花药内壁结构凌乱，不能观察到有规则排列的乌氏体，明显呈现出异常形态。野生型中恢8015花粉外壁覆盖一层孢粉素，花粉外壁呈现环状突起，而突变体fignl1花粉外壁杂乱无章，无明显类似野生型的环状突起。与野生型中恢8015相比，fignl1突变体花粉粒不规则，花粉内部无淀粉粒、精细胞和营养细胞；fignl1突变体花粉内外壁发育异常，基足层和覆盖层更肥厚(图3a～j)。

实施例4fignl1突变体雄配子减数分裂染色体观察

野生型中恢8015和突变体fignl1花粉母细胞减数分裂时期染色体制备；田间收集野生型中恢8015和突变体fignl1减数分裂时期适当的幼穗，用卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)进行固定，用真空泵缓慢抽气30分钟，样品沉到瓶底，更换新鲜的卡诺固定液室温放置24小时；挑选时期适当的水稻颖花于载玻片上，用解刨针将花药挑出，滴加一滴醋酸洋红，用解剖针针尖迅速将花药捣碎，从而释放出花粉母细胞，将载玻片置于相差显微镜下观察，以挑选处于减数分裂时期的花粉母细胞；选取花粉母细胞处于减数分裂不同时期的花药，再滴加适量的醋酸洋红后，盖上盖玻片并用镊子的另一端或者大拇指垂直方向轻压盖玻片；在酒精灯火焰上方瞬时烘烤载玻片后，在载玻片一测滴加适量45％醋酸，在载玻片的另一侧放置一张吸水滤纸。通过滤纸吸水作用将醋酸洋红吸干净；将载玻片置于酒精灯火焰上方瞬时烘烤至烫手但未沸腾为止；将载玻片冷却，在液氮浸泡中30秒，取出载玻片用刀片迅速揭去盖玻片晾干，依次经酒精梯度脱水(70％、90％、100％)，取出载玻片，晾干待用。每张载玻片滴加约10μl(工作液浓度为10μg/ml)dapi(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)细胞核染色液，盖上盖玻片，注意不能有气泡，黑暗5分钟后，在荧光显微镜下观察拍照。细胞学观察表明：fignl1突变体在减数分裂粗线期出现细丝状染色体，在终变期出现大量的相互缠绕的多价染色体、畸形染色体并且出现染色体桥。在减数分裂中期出现未配对的染色体和染色体桥。在第二次减数分裂过程中fignl1突变体的性母细胞中出现染色体碎片和落后的染色体，并且在四分体中能够观察到微核的存在，最终导致fignl1突变体不能形成有规则的四分体结构(图4a～j、图5a～0)。

实施例5osfignl1基因的图位克隆

中恢8015经⁶⁰co-γ诱变得到稳定的不育突变体fignl1为母本，以中花11为父本，进行杂交得到f1代，f1代自交后产生的f2代中具有fignl1突变体表型的植株被用来定位基因。f2种植于中国水稻研究所试验田，抽穗后观察f2群体分离出的隐性单株花药表型，取花粉败育植株的新鲜叶片，采用ctab法提取水稻总dna。用均匀分布于水稻12条染色体上的ssr引物和indel引物检测中花11和中恢8015的多态性，中花11和中恢8015在水稻12条染色体上有多态的引物有97个，用这些有多态性引物分析两个亲本和f2群体中8个隐性突变体，发现位于第12号染色体上的rm27877和indel162分子标记与不育表型存在较明显的连锁。利用f2群体中80个隐性单株，将osfignl1目的基因初步定位在水稻12号染色体长臂上，位于分子标记rm27877和indell62之间，跨越着丝粒，物理距离约35.7mb。初定位之后扩大遗传群体，根据水稻不育基因的初步定位结果，同时利用数据库中已公布的日本晴和9311的序列信息，继续开发设计新的多态性indel分子标记，进一步用f2、f3群体中2300个隐性单株进行精细定位，最终将osfignl1定位在12染色体短臂新开发的indel分子标记s7和s8之间，两个标记间的物理距离约250kb，定位区间内包含12个开放阅读框。应用引物：rs6-f：cggcccatatagaaagccca，rs-r：tgtgcagacacaactacccc分别扩增野生型中恢8015以及fignl1突变体中osfignl1dna序列，通过测序后发现：与野生型中恢8015相比，fignl1突变体在os12g0443800.1的第三个外显子存在一个单碱基a的缺失，导致所编码蛋白在第187位氨基酸处发生翻译提前终止。

野生型中恢8015及突变体osfignl1基因序列比对结果见图6。

实施例6转基因互补验证osfignl1基因功能

以野生型中恢8015基因组为模板，以1300-osfignl1-f：ccatgattacgaattcagtgctagcgagggtcagat，1300-osfignl1-r：taccgagctcgaattccttctcactcaccgttgcct为引物，通过kod-fx酶扩增出野生型中恢8015基因组dna片段，包括osfignl1完整的orf，起始密码子上游2450bp和终止密码子下游1200bp序列。基因osfignl1的核苷酸序列及其cdna序列分别如seqidno：1和2所示。

引物5’端含有pcambia1300载体ecori酶切位点附近的序列。应用clontech公司in-fusionhdcloning试剂盒(货号：pt5162-1)，将回收产物插入到经过ecori消化后的线性化载体pcambia1300(具体使用参照说明书)。重组质粒转化大肠杆菌dh5a感受态，并涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上，放置在37℃培养箱培养至长出均匀分布的单菌落后，挑选阳性单克隆进行摇菌培养。经过菌液pcr扩增、质粒酶切鉴定、测序等检测程序，将测序正确的质粒命名为pcambia1300-osfignl1。

通过农杆菌介导法将目标载体转入水稻突变型fignl1受体中。水稻突变型fignl1受体为诱导杂合基因型种子分离出fignl1纯合基因型种子的愈伤，测序挑选出fignl1基因型的愈伤。通过pcr转基因鉴定，总共得到3棵转基因阳性植株。表型鉴定结果显示：在大田生长条件下，转基因阳性植株正常状态和野生型中恢8015无明显差异。至水稻抽穗期时花药成熟，取转基因阳性植株花药，成熟花粉粒碘化钾染色可以看出，花粉粒成功染色，说明fignl1突变体的花粉育性得以恢复。由此表明，osfignl1基因控制水稻育性，突变体雄性不育表型是确系由osfignl1功能性缺失引起(图7a～e)。

以上结果充分说明osfignl1是一个水稻育性基因，在水稻减数分裂过程中起主要作用。通过诱变分离得到一个雄性不育性状稳定的fignl1突变体，该突变体的表型不同于以前报道的减数分裂突变体，为研究减数分裂同源重组机制提供了一种的优良的实验材料，同时也为杂交育种工作提供了一种新的材料。基因osfignl1今后可作为一个水稻减数分裂调控的功能基因应用于水稻杂种优势创制工作中，具有巨大的开发利用价值，市场应用前景广阔。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>水稻雄性不育基因osfignl1及其应用

<130>pi201710402

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7632

<212>dna

<213>水稻

<220>

<221>misc_feature

<222>(2467)..(2467)

<223>n=a或碱基缺失

<400>1

atggcggagcagtctcacgccggcgacggcggcggcggcggcgcgggctccggggagccg60

acgaactggaggaaggaggcggacgataggctgcggcggctccactccctccagttcggc120

gcggacgtcgcgctggagggcaaggaccccgcgggggcgcaggtgctcgcgctccgcctc180

ctcggcttcctcgactcgcaggccctccccggcgacggcggcgcggcgggccacgaggcc240

agcttcgtcgcgcccatccgcgccgcggcgtcatccagcgtcgccgccgccatccgcgcc300

cgcgccgggaggtcagacaggtacaaaaccctacccccccccccccccccaaacacagcc360

acgccaccccgcgcgctctcccgcattttcgcccaaatcatgcgttgagacggctcgccg420

tgtttacgagggtctcctcgattcgattcgggcgaagagtgggagcgatttggatggatt480

tgctttcgctattattcagattgtgcaaatatatagagccattagctgatactgtagtat540

tcacttaatgtggtatttatatagctctagaaatctgtggattttggagaattgccgtga600

ctaagatgaactggtaccgtgtgcacaaacaagcaagctaagtactagtgcctccactgt660

ttgtgttgggtggttctcgggagcttgcttttatttgtttccaaatacattaagctatct720

aatgtaatattagtatgctatatacattatattttgctggaatggaaataaaataataca780

cgctgctcttcctcttagcatatagtgtcttttttatgcatgctctatgaagcaaaacaa840

tattgaccagagcaggcataatggtgccgaaagtcatgtgtaattgtgggaaagtaattt900

ttcaaagcaaagggtactcaaaggtgatggtctatcttccaccatgattagtggtatgta960

tatgttgaatacatgtggatcacataattcaaattgcatatcctgtttaggattcgttgc1020

tccctatagtaggattcaacccactagaccttgactcaagtttagaaattgttgtctaaa1080

taaatagggccaagaacattttttcttcttatgttgcacattgtgtactgaaatattttt1140

gcctttttgtttgtgctcattgtttaagtgaggaagaaatcaccaggttaccactgcggc1200

agtggttgacatcagcctgtgttttggttcaattttaaggtcctcagatcattccatgta1260

tgtgctaagcatgtttgaattgactaacatattcatataccactacaagttagattcaga1320

tataagtgttgcaggacatacacatgtcttcattattaatgtgctgcgatctggtaaata1380

acgattgtggcgttgcagaaatcactgtcagggctaagcaagtaagcatgaaagttaagg1440

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ctgatatttgtagtcaaaataattttatagtagagatgatagcagtagcagatattatca1560

gggtcaggactactggactagtaaatttttggaaatgtgatttctttttggtggtggtac1620

ggataccatatgcattggagcattaagttgccatcactgatggaaactgagtggcttctt1680

gggtttaatcttgaacaaatagttgtctatttcatttttgaccggaaacagtgagggagg1740

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