一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域中一个植物耐镉相关蛋白及其编码基因与应用,特别涉及利用该基因增强植物对镉毒害耐受及降低其体内镉含量的方法。

背景技术：

重金属污染已成为全球性的环境问题之一，也是当今世界所面临的重要难题之一。由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如镉、铅、汞、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。重金属，特别是镉、铅、汞、铬等具有显著的生物毒性。它们在水体中不能被微生物降解，而只能以各种形态相互转化和分散，发生富集过程，并经过食物链为人体摄取和积累。土壤中的重金属污染会使得土壤的组成、结构和功能在一定程度上发生变化，导致微生物活动过程受到抑制，使得有害有毒物质或分解产物在土壤中不断积累，不但会损害土壤自身的理化性质，从而影响作物的产量与品质，而且也会通过食物链进入人体，被人体吸收，危害人类健康。进入人体的重金属，尤其是有害的重金属，有的会在人体内积累和浓缩，如果超过人体所能耐受的限度，可造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等危害。所以提高作物对重金属的耐受和降低对重金属的吸收已经成为关系民生的大事，已经成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

拟南芥作为一种模式植物,被广泛应用于植物遗传学、作物生物学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到,有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究，并且其还具有结构简单、形体小、生长周期较短、繁殖系数高、生活力强、自花授粉和易于转化等特点，因此将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件。因此,对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组小，在2000年就完成了其全基因组的测序工作，成为植物界中第一个被完整测序的物种，在互联网上能够查找到拟南芥基因组的核苷酸序列。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一,也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对,2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚,利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究,发现了一些与植物相关的耐受重金属的基因,如atatm3,atacbp，atpdr1,atpdr8等。

面对日益严重的环境污染问题,寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因与应用。本发明的第二个目的是提供一种利用该编码基因增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方法。

本发明所提供的增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因，名为wrky13(at4g39410)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

（1）序列表中的seqidno：2；

（2）序列表中的序列2由304氨基酸残基组成。

wrky13的编码基因也属于本发明的保护范围。

wrky13的cdna基因,选自下述核甘酸序列之一；

（1）序列表中seqidno：1的dna序列；

（2）编码序列表中seqidno：2蛋白质序列的多核苷酸；

（3）在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的dna序列杂交的核甘酸序列；

（4）与序列表中seqidno：l限定的dna序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的dna序列。

含有本发明wrky13的表达载体,细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增wrky13中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方法，是使植物中的上述植物耐镉及降低植物中镉含量相关蛋白编码基因过量表达。

本发明中将植物中的上述植物耐镉相关蛋白编码基因wrky13过量表达所采用的方法是利用基因工程技术构建35s:wrky13过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为耐镉。将wrky13基因构建到植物表达载体中时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所使用的载体进行加工，使其具有抗性的抗生素标记物（卡那霉素）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明wrky13基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物耐镉相关蛋白及其编码基因可为农作物耐镉育种和降低农作物中的镉积累提供基因资源和技术支持。

根据拟南芥数据库公布的基因组序列，wrky13(at4g39410)是拟南芥wrky转录因子家族中的成员，wrky是近年来在植物体内新发现的特有转录调控因子，属于wrky家族转录调控因子。申请人发现镉处理wrky13基因过表达植株表现为对镉耐受，这表明该wrky13基因涉及镉耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，研究结果表明，在wrky13基因过量表达时镉处理可诱导镉离子转运蛋白atpdr8基因转录水平显著提高，这说明基因wrky13可以激活拟南芥中镉离子转运蛋白atpdr8编码基因的表达从而使拟南芥体内的镉含量下降，进而表现为对镉耐受。

附图说明

图1为xcd3-d突变体与野生型植株（wt）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于½ms、10μmβ-estradiol、60μmcdcl2、10μmβ-estradiol与60μmcdcl2的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中½ms培养基为对照（a½ms；b10μmβ-estradiol；c60μmcdcl2；d10μmβ-estradiol+60μmcdcl2；e根长；f鲜重）。

图2为wrky13基因的克隆及其转化（atail-pcr电泳结果;b目的基因转化大肠杆菌dh5α的结果）。

图3为t-dna插入位点示意图。

图4vew1在不同浓度β-estradiol处理下的表达水平。

图5为转基因植株wrky13-oe1、oe2、oe3与野生型植株垂直培养，直接点种于含有或不含有镉的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中½ms培养基为对照（a½ms;b50μmcdcl2;c75μmcdcl2;d根长；e鲜重）。

图6为转基因植株wrky13-oe1、oe2与野生型植株分别在含有50μmcdcl2的½ms培养基上垂直生长2周后镉含量的比较。

图7野生型与转基因过表达wrky13基因的植株oe1、oe2的镉含量比较。

图8为转基因过表达wrky13基因的植株wrky13-oe1、oe2与野生型植株在½ms培养基上正常生长2周，再用50μmcdcl2处理6h后相关基因的表达水平。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、wrky13及其编码基因的获得

我们利用中国科学院左建儒教授实验室创建的突变体库筛选重金属镉耐受突变体。参见图1，该突变体库是利用化学诱导激活xve(lexa-vp16-er)系统构建的t-dna插入突变体。在200μmcdcl2的胁迫条件和10μm外加激素β-estradiol的诱导作用下，筛选获得镉耐受的功能获得型的突变株，命名为xcd3-d。根据在镉胁迫下xcd3-d表现出比wt更加耐受的性状，我们推测xcd3-d突变体中某个基因可能在β-estradiol作用下出现表达差异，使得xcd3-d突变体比wt对重金属镉胁迫更加耐受。

参见图2，为进一步研究xcd3-d突变体对镉胁迫耐受的原因，我们选取适量土培条件下拟南芥xcd3-d突变体的叶片，利用ctab法提取xcd3-d突变体基因组dna。根据xve载体的lexaoperator序列，利用3个依次渐进的特异性引物lexa2，lexa3和lexa4，以及随机引物ad2，进行tail-pcr克隆目的序列。通过3轮pcr循环，第三轮产物与第二轮产物中相差约70bp的条带，与理论值符合，判断是目的序列。回收纯化目标条带（图2a），应用ta克隆连接到pucm-t载体，再转化到感受态大肠杆菌dh5α中，挑取阳性单克隆（图2b），在lb液体培养基中扩培，送公司测序。

测序结果在ncbi数据库blast比对，综合分析得出t-dna插入位点信息。参见图3，其中t-dna插入在基因wrky13（at4g39410）起始密码子atg上游2345bp处(图3)，这一区域极可能是该基因的启动子区，在外加激素β-estradiol的诱导作用下，该载体的35s启动子起始转录，致使基因激活表达，见图4，引起了xcd3-d突变体对重金属镉的耐受。

实施例2、培育耐镉及降低镉含量的拟南芥

1、wrky13基因过量表达转基因株系wrky13-oe1、oe2的获得

为进一步验证该基因在植物重金属镉胁迫调控中的功能，我们构建了wrky13基因过量表达载体（35s:wrky13）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在½ms培养基上正常培养两周，提取植株总rna，反转录合成cdna，以合成的cdna为模板，进行pcr，扩增出足够量的目的产物，见图5a。再以pcr产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将pcr产物与载体pcambia1301进行酶切回收，见图5b。再将回收纯化好的目的dna片段和载体用t4dna连接酶连接过夜。将上述连接液转入dh5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序，见图5c。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌gv3101。电击转化后的农杆菌gv3101，经活化后涂布于含双抗（kan，gen）的lb培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（kan，gen）的lb培养液中扩培并抽提质粒。用ncoi和bsteⅱ双酶切鉴定重组载体无误，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得wrky13基因过表达转基因株系，见图5d。

2、wrky13过表达转基因植株与野生型植株的耐镉性比较

参见图6，选择代表性过表达转基因株系wrky13-oe1、oe2和oe3，将野生型(wt)与wrky13-oe1、oe2、oe3同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加镉和不加镉的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：在½ms培养基上生长的wt和wrky13-oe1、oe2、oe3在鲜重、根长等方面均无显著差异。在植株直接点种在含有不同浓度镉的培养基上培养，wrky13-oe1、oe2和oe3都表现出明显的镉耐受的性状。在50μmcdcl2和75μmcdcl2胁迫下，wrky13-oe1、oe2、oe3的鲜重和根长明显比wt高。上述结果表明，wrky13-oe1、oe2、oe3较wt对镉毒害表现出明显耐受。

3、wrky13过表达转基因植株与野生型植株的镉积累比较

参见图7，对在含有50μmcdcl2的½ms培养基上垂直生长2周后的野生型植株wt和wrky13-oe1和oe2植株体内的镉含量进行测定，发现转基因植株体内镉含量明显低于wt，表明转基因植株对镉积累明显低于wt植株。

4、镉胁迫下wrky13过表达转基因植株与野生型植株镉胁迫pdr8基因表达比较

参见图8，取在½ms培养基上正常生长2周，再用60μmcdcl2处理6h后的wt和wrky13-oe1、oe2植株适量，提取rna，反转后进行qrt-pcr，对相关基因表达水平进行测定，发现wrky13-oe1、oe2植株体内atpdr8基因明显高于wt，表明wrky13-oe1、oe2植株对镉积累可能与atpdr8基因的激活有关。

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<110>合肥工业大学

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