就减少的镉转运进行修饰的转基因植物、衍生产物和相关方法

就减少的镉转运进行修饰的转基因植物、衍生产物和相关方法
【专利摘要】本发明部分涉及转基因植物，包括转基因烟草植物和衍生种子，其进行遗传修饰以通过减少HMA相关转运蛋白的表达水平，阻碍从转基因植物的根系到气生部分的镉(Cd)转运。本发明包括经遗传修饰以稳定表达编码RNAi多核苷酸的RNAi构建体的转基因烟草植物，所述RNAi多核苷酸使得内源NtHMA?RNA变体的降解成为可能。在转基因植物中NtHMA转运蛋白表达的减少导致叶片中基本上减少的镉(Cd)含量。通过并入衍生自转基因烟草植物的叶可以产生基本上不含或在Cd含量中基本上减少的各种消费品，所述转基因烟草植物进行修饰以减少NtHMA转运蛋白的表达。
【专利说明】就减少的镉转运进行修饰的转基因植物、衍生产物和相关方法
[0001]本申请是申请日为2008年12月11日、申请号为200880125345.2、发明名称为“就减少的镉转运进行修饰的转基因植物、衍生产物和相关方法”的发明专利申请的分案申请。

【技术领域】
[0002]组合物、表达载体、多核苷酸、多肽、转基因植物、转基因细胞系和转基因种子、以及制备且使用这些实施方案以产生可以减少重金属转运到气生部分内的各种植物的方法。
[0003]与相关申请的交叉参照
[0004]本申请要求于2007年12月13日提交的美国临时专利申请号60/996，982的优先权，所述美国临时专利申请号的完整内容通过引用在此合并。
[0005]发明背景
[0006]植物通过各种转运机制从其环境中吸收金属离子底物而获得必需重金属，例如Zn、Ni和Cu，所述转运机制由在根细胞和各种维管组织的表面上表达的膜转运蛋白介导。分类为P型ATP酶例如PlB型ATP酶的转运蛋白，是通过利用从放能ATP水解反应释放的能量转移带正电的底物穿过质膜的转运蛋白。PlB型ATP酶也称为重金属ATP酶(“HMA”)或CPx型ATP酶。HMA已通过底物特异性分成2个亚类，Cu/Ag和Zn/Co/Cd/Pb组。在植物中表征的第一种PlB型ATP酶是从拟南芥属(Arabidopsis)中克隆的AtHMA4。通过HMAs的底物特异性并不严格限制于必需金属的转运，因为几种非必需金属可以无差别地识别为底物，导致许多非必需金属例如Cd、Pb、As和Hg的累积。
[0007]发明概述
[0008]本发明的多个方面涉及用于产生转基因植物包括转基因烟草植物的组合物和方法，所述转基因植物经遗传修饰以通过减少HMA家族的转运蛋白的表达水平而阻碍从根系到叶片(leaf lamina)的镉(Cd)转运。HMA同系物(“NtHMA”)已在烟草中得到鉴定，其可以用于构建多种RNAi构建体，编码可以促进内源NtHMA RNA转录物降解的目的NtHMARNAi多核苷酸。可以表达根据本发明的NtHMA RNAi多核苷酸的转基因植物可以用于减少NtHMA RNA转录物的稳态水平，并且因此用于减少可用于转运金属穿过细胞膜的功能活性NtHMA转运蛋白的数目。
[0009]本发明的其他方面涉及包括多种NtHMA RNAi构建体的重组表达载体，经遗传修饰以内源表达NtHMA RNAi多核苷酸的转基因植物和种子，衍生自转基因植物和种子的细胞系，和并入衍生自根据所公开方法产生的转基因植物的叶的消费品。
[0010]根据本发明，在一个方面提供了选自下述的经分离的多核苷酸:
[0011]包括这样的序列或由这样的序列组成且编码具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白的多核苷酸，所述序列与SEQ ID NO:1具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0012]包括这样的序列或由这样的序列组成的多核苷酸，所述序列与SEQ ID N0:3具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0013]包括这样的序列或由这样的序列组成的多核苷酸，所述序列与SEQ ID N0:47具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0014]包括编码这样的多肽的序列或由编码这样的多肽的序列组成的多核苷酸，所述多肽与 SEQ ID NO:2 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70 %序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白；和
[0015]包括编码这样的多肽的序列或由编码这样的多肽的序列组成的多核苷酸，所述多肽与 SEQ ID NO:49 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白。
[0016]本发明的经分离的多核苷酸可以在高严格条件下与这样的核酸分子杂交，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1、3或47或SEQ ID NO:1、3或47的互补序列或由SEQ ID NO:1、3或47或SEQ ID NO:1、3或47的互补序列组成。
[0017]本发明的另一个方面是包括如本文所定义的经分离的多核苷酸的表达载体。
[0018]还提供的是通过这样的方法制备的转基因植物，所述方法包括引入如本文所定义的经分离的多核苷酸或如本文所定义的表达载体。转基因植物可以是例如烟草植物。
[0019]进一步提供的是通过这样的方法制备的细胞系，所述方法包括引入如本文所定义的经分离的多核苷酸或如本文所定义的表达载体。
[0020]在一个进一步的方面，提供了并入从如本文所定义的转基因植物中收获的叶的可消费烟草产品(例如但不限于可抽吸物品(smoking article)或无烟烟草制品)。
[0021]在另一个方面，提供了能够抑制它与之相对应的NtHMA信使RNA表达的NtHMARNAi构建体，所述构建体包括:
[0022]与SEQ ID NO:3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性的第一序列；
[0023]第二序列；和
[0024]以与第一序列相同的定向放置的、具有第一序列的反向互补序列的第三序列，
[0025]其中第二序列放置在第一序列和第三序列之间，并且第二序列与第一序列和第三序列可操作地连接。
[0026]在NtHMA RNAi 构建体中:
[0027](a)第一序列可以与选自下述一个或多个的序列具有至少50^^55^^60 %、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:外显子I (SEQ ID NO:5)、外显子I (SEQ ID NO:5)的片段、外显子2 (SEQID NO:7)、外显子 2 (SEQ ID NO:7)的片段、外显子 3 (SEQ ID NO:9)、外显子 3 (SEQ ID NO:9)的片段、外显子4 (SEQ ID NO: 11)、外显子4 (SEQ ID NO:11)的片段、外显子5 (SEQ IDNO: 13)、外显子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外显子 6 (SEQ ID NO: 15)、外显子 6 (SEQ ID NO:15)的片段、外显子7 (SEQ ID NO: 17)、外显子7 (SEQ ID NO:17)的片段、外显子8 (SEQ IDNO:19)、外显子 8 (SEQ ID NO:19)的片段、外显子 9 (SEQ ID NO:21)、外显子 9 (SEQ ID NO:
21)的片段、外显子10 (SEQ ID NO:23)、外显子10 (SEQ ID NO:23)的片段、外显子11 (SEQID NO:25)、和外显子 11 (SEQ ID NO:25)的片段；
[0028](b)第二序列可以与选自下述一个或多个的序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:内含子I (SEQ ID NO:4)、内含子I (SEQ ID NO:4)的片段、内含子2 (SEQID NO:6)、内含子 2 (SEQ ID NO:6)的片段、内含子 3 (SEQ ID NO:8)、内含子 3 (SEQ ID NO:8)的片段、内含子4 (SEQ ID NO: 10)、内含子4 (SEQ ID NO:10)的片段、内含子5 (SEQ IDNO: 12)、内含子 5 (SEQ ID NO: 12)的片段、内含子 6 (SEQ ID NO: 14)、内含子 6 (SEQ ID NO:14)的片段、内含子7 (SEQ ID NO: 16)、内含子7 (SEQ ID NO:16)的片段、内含子8 (SEQ IDNO: 18)、内含子 8 (SEQ ID NO: 18)的片段、内含子 9 (SEQ ID NO: 20)、内含子 9 (SEQ ID NO:20)的片段、内含子10 (SEQ ID NO:22)、内含子10 (SEQ ID NO:22)的片段、内含子11 (SEQID NO:24)、内含子 11 (SEQ ID NO:24)的片段、内含子 12 (SEQ ID NO:26)、和内含子 12 (SEQID NO:26)的片段；
[0029](c)第三序列可以与选自下述一个或多个的序列具有至少50^^55^^60 %、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:27 的片段、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28 的片段、SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:29 的片段、SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:30 的片段、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO: 31 的片段、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32 的片段、SEQ ID NO:33、SEQID NO:33 的片段、SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:34 的片段、SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:35 的片段、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:36 的片段、SEQ ID NO:37、和 SEQ ID NO:37 的片段；
[0030](d)第一序列可以包括SEQ ID NO:38，第二序列可以包括SEQ ID N0:39，并且第三序列可以包括SEQ ID NO:40 ；
[0031](e)第一序列可以包括SEQ ID NO:42，第二序列可以包括SEQ ID N0:43，并且第三序列可以包括SEQ ID NO:44 ;或
[0032](f)可以应用(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一个或两个或三个。
[0033]本发明还涵盖包括启动子的表达载体，所述启动子放置在如本文所定义的NtHMARNAi构建体的上游且与之可操作地连接。启动子可以选自:组织特异性启动子、诱导型启动子和组成型启动子。
[0034]在NtHMA RNAi构建体中，第一个和第二序列可以各自具有选自下述的长度:20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸、和600-700个核苷酸。
[0035]本发明的一个进一步方面是包括如本文所定义的RNAi (或NtHMA RNAi构建体或表达载体)的转基因植物，其中与非转基因对应物中的部分相比较，所述转基因植物在植物的至少部分中具有减少的Cd水平。转基因植物可以是例如烟草植物。
[0036]还提供的是并入从包括如本文所定义RNAi的转基因植物中收获的叶的可消费烟草产品(例如但不限于可抽吸物品或无烟烟草制品)。
[0037]产品可以具有至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的％ Cd 减少值。
[0038]产品可以具有值为约0.01至约0.05ppm、约0.01至约0.lppm、约0.01至约0.5ppm、约0.01至约1.0ppm、或约0.01至约5ppm的Cd含量。
[0039]在本发明的另一个方面，提供的是用于减少植物的至少部分中的Cd水平的方法，其包括:
[0040]通过引起RNAi构建体的表达减少植物中的NtHMA mRNA水平。
[0041]对于这种方法，RNAi构建体可以是如本文所定义的，并且特别可以包括:
[0042]与SEQ ID NO:3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一丨生,例如至少90%序列同一丨生的第一序列；
[0043]第二序列；和
[0044]以与第一序列相同的定向放置、具有第一序列的反向互补序列的第三序列，
[0045]其中第二序列放置在第一序列和第三序列之间，并且第二序列与第一序列和第三序列可操作地连接。
[0046]根据该方法， 在RNAi构建体表达后，植物的部分可以具有减少至少约5%、10%、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的 Cd 含量。
[0047]另外或备选地，在RNAi构建体表达后，植物的部分可以具有约0.01至约0.05ppm、约 0.01 至约 0.lppm、约 0.01 至约 0.5ppm、约 0.01 至约 1.0ppm、或约 0.01 至约 5ppm 的 Cd含量。
[0048]根据本发明的一个进一步的方面，提供的是与SEQ ID NO:2或49具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性或至少95%序列同一性的基本上纯化的多肽，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白。
[0049]与如本文所定义的多肽特异性结合的抗体也由本发明涵盖，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2 或 49 或由 SEQ ID NO:2 或 49 组成。
[0050]下文描述了本发明的进一步和多个方面(在本文中也称为“实施方案”)。
[0051]附图简述
[0052]图1是包括11个外显子的NtHMA基因组克隆的示意图。
[0053]图2A举例说明用于构建NtHMA RNAi表达载体的示例性亚克隆策略，所述NtHMARNAi表达载体使得目的NtHMA RNAi多核苷酸的组成性表达成为可能，如实施例2中描述的。
[0054]图2B举例说明由NtHMA RNAi多核苷酸内的分子内、碱基配对相互作用形成的假定双链RNA双链体(作为“茎-环-茎”结构)，所述NtHMA RNAi多核苷酸作为由示例性NtHMA RNAi构建体转录的产物产生。
[0055]图3A显示用于产生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列，NtHMA (660-915)，如实施例2中描述的。
[0056]图3B-3D显示在代表3个变种的多个第一代(TO)转基因品系的叶片中的Cd减少，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达NtHMA RNAi多核苷酸(660-915)，如实施例5中描述的。
[0057]图4A显示用于产生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列，NtHMA (1382-1584)，如实施例3中描述的。
[0058]图4B-4D显示在代表3个变种的多个第一代(TO)转基因品系的叶片中的Cd减少，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达NtHMA RNAi多核苷酸(1382-1584)，如实施例5中描述的。
[0059]图5A-C显示在多个第一代(TO)转基因品系中的标准化NtHMA RNA转录物水平，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达目的NtHMA RNAi多核苷酸，如通过叶片提取物的定量实时PCR分析测定的，如实施例6中描述的。
[0060]图6显示在多个第一代(TO)转基因品系的叶片和根之间的Cd和Zn分布，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达目的NtHMA RNAi多核苷酸，如表2中呈现的和实施例7中描述的。
[0061]图7显示在多个第一代(TO)转基因品系的树皮(“B”)、叶片(“L”)、木髓(“P”)和根(“R”)组织中的Cd分布，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达目的NtHMA RNAi多核苷酸，如表3中呈现的和实施例8中描述的。
[0062]图8显示在多个第二代(Tl)转基因品系的叶片(“L”)和根(“R”)之间的Cd分布，所述转基因品系已进行遗传修饰以表达目的NtHMA RNAi多核苷酸，如实施例9中描述的。
[0063]发明详述
[0064]1.烟草NtHMA基因和基因产物的分离
[0065]图1是包括11个外显子的NtHMA基因组克隆的示意图，所述外显子编码与HMA转运蛋白家族相关的重金属转运蛋白。实施例1进一步描述了 NtHMA基因组克隆(_H0-18-2)和4个NtHMA cDNA克隆的鉴定。下表1提供了与在NtHMA基因组克隆(_Η0_18_2)内作图的外显子和内含子亚区相对应的核苷酸位置。
[0066]A.NtHMA 多核苷酸
[0067]术语“多核苷酸”指长度包括至少10个碱基的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂交物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合、以及碱基和/或修饰的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。该术语包括单链和双链形式的DNA或RNA。术语“DNA”包括基因组DNA、cDNA、化学合成的DNA、PCR扩增的DNA及其组合/等价物。术语“经分离的多核苷酸”指与起源任何的基因组不邻接、或从天然背景中分离的多核苷酸。该术语包括任何重组多核苷酸分子，例如NtHMA RNAi构建体、NtHMA RNAi表达载体、NtHMA基因组克隆及其片段和变体。
[0068]如图1中所示，指定为SEQ ID NO:1的NtHMA基因组克隆包括:内含子I (SEQ IDN0:4)、外显子 1(SEQ ID NO:5)、内含子 2 (SEQ ID N0:6)、外显子 2 (SEQ ID N0:7)、内含子 3 (SEQ ID NO: 8)、外显子 3 (SEQ ID NO: 9)、内含子 4 (SEQ ID NO: 10)、外显子 4 (SEQ IDNO: 11)、内含子 5 (SEQ ID NO: 12)、外显子 5 (SEQ ID NO: 13)、内含子6 (SEQ ID NO: 14)、外显子 6 (SEQ ID NO: 15)、内含子 7 (SEQ ID NO: 16)、外显子 7 (SEQ ID NO: 17)、内含子 8 (SEQ IDNO: 18)、外显子8 (SEQ ID NO: 19)、内含子9(SEQ ID N0:20)、外显子9 (SEQ ID N0:21)、内含子 10 (SEQ ID NO: 22)、外显子 10 (SEQ ID NO: 23)、内含子 11 (SEQ ID NO: 24、外显子 11 (SEQID NO:25)、和内含子12(SEQ ID NO:26)。关于序列，参见下文序列表。本发明的多个实施方案涉及代表在NtHMA基因座处分离的基因组片段的经分离的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多核苷酸变体，其包括与 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:1 的片段至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0069]多个实施方案涉及具有互补于NtHMA多核苷酸变体的序列的经分离的多核苷酸，所述变体包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的片段至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。多个实施方案涉及这样的经分离的多核苷酸，其可以在中至高严格条件下与多核苷酸特异性杂交，所述多核苷酸包括 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:1 的片段。
[0070]多个实施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6663)的经分离的多核苷酸，其包括SEQ IDN0:3、SEQ ID NO:3的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多核苷酸变体，其包括与 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多核苷酸变体，其包括与SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替换(例如RNA)。多个实施方案涉及这样的经分离的多核苷酸，其可以在中至高严格条件下与多核苷酸特异性杂交，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的片段。多个实施方案涉及具有互补于NtHMA多核苷酸变体的序列的经分离的多核苷酸，所述变体包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的片段至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0071]多个实施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6643)的经分离的多核苷酸，其包括SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:47的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多核苷酸变体，其包括与 SEQ ID N0:47 或 SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96 %、97%、98 %和99 %序列同一性。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多核苷酸变体，其包括与 SEQ ID N0:47 或 SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替换(例如RNA)。多个实施方案涉及这样的经分离的多核苷酸，其可以在中至高严格条件下与多核苷酸特异性杂交，所述多核苷酸包括SEQ ID N0:47或SEQ ID NO:47的片段。多个实施方案涉及具有互补于NtHMA多核苷酸变体的序列的经分离的多核苷酸，所述变体包括与SEQ ID N0:47或SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0072]多个实施方案涉及与NtHMA多核苷酸和NtHMA多肽同源的生物聚合物(“NtHMA同系物”)，其可以从不同植物物种中鉴定。例如，NtHMA同系物可以通过筛选衍生自不同目的植物物种的合适核酸文库在实验上分离。备选地，NtHMA同系物可以利用衍生自NtHMA多核苷酸和/或NtHMA多肽的序列通过筛选包含来自一个或多个物种的序列的基因组数据库得到鉴定。此类基因组数据库可对于许多物种容易地获得(例如在环球网(《?W)上在tigr.0rg/tdb ；genetics.wise, edu ；stanford.edu/.about, ball ；hiv-web.1an1.gov ；ncb1.nlm.nig.gov ；eb1.ac.uk ;和 pasteur.fr/other/b1logy 处)。例如，简并寡核苷酸序列可以通过“回译”由NtHMA多肽片段获得。NtHMA多核苷酸可以可以用作探针或引物以鉴定/扩增相关序列，或例如通过PCR或通过其他众所周知的技术(例如，参见PCR Protocols:AGuide to Methods and Applicat1ns, Innis等人，编辑,Academic Press, Inc.(1990))获得关于相关NtHMAs的全长序列。
[0073]B.NtHMA 多肽
[0074]术语“NtHMA多肽”指包括指定为SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；与SEQ IDNO:2具有基本同源性(即序列相似性)或序列同一性的多肽；SEQ ID NO:2的片段；及其变体。NtHMA多肽包括与SEQ ID NO:2具有足够或基本同一性或相似性程度并且可以通过转运重金属穿过细胞膜起作用的序列。
[0075]NtHMA多肽包括通过引入任何类型的改变(例如，氨基酸的插入、缺失或置换；糖基化状态中的改变；影响重折叠或异构化、三维结构或自结合状态的改变)而产生的变体，其可以是有意改造的或天然分离的。NtHMA多肽可以为线性形式的或使用已知方法环化的(例如 H.U.Saragovi,等人，B1/Technology 10, 773 (1992);和 R.S.McDowell,等人，J.Amer.Chem.Soc.11 4:9245 (1992)，两者都通过引用合并入本文)。NtHMA多肽包括至少8至10个、至少20个、至少30个或至少40个邻接氨基酸。
[0076]多个实施方案涉及由多核苷酸序列SEQ ID NO:1编码的经分离的NtHMA多肽，包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多肽变体，包括与 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0077]多个实施方案涉及经分离的NtHMA多肽(克隆P6663)，包括SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:2的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多肽变体，包括与SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一'I"生。
[0078]多个实施方案涉及经分离的NtHMA多肽(克隆P6643)，包括SEQ ID NO:49、SEQID NO:49的片段或其变体。多个实施方案涉及经分离的NtHMA多肽变体，包括与SEQ IDN0:49 或 SEQ ID NO:49 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。
[0079]I1.用于减少NtHMA基因表达和/或NtHMA介导的转运蛋白活性的组合物和相关方法
[0080]可以下调NtHMA和NtHMA变体的表达和/或活性的合适拮抗性组合物包括可以干扰一种或多种内源NtHMA基因的转录的序列特异性多核苷酸；可以干扰NtHMA RNA转录物的翻译的序列特异性多核苷酸(例如，dsRNA、siRNA、核酶)；可以干扰NtHMA的蛋白质稳定性、NtHMA的酶促活性、和/或NtHMA就底物和/或调节蛋白质而言的结合活性的序列特异性多肽；显示关于NtHMA的特异性的抗体；和可以干扰NtHMA的蛋白质稳定性、NtHMA的酶促活性、和/或NtHMA的结合活性的小分子化合物。有效拮抗剂可以使重金属(例如Cd)转运到叶片结构内减少至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。
[0081]A.定义
[0082]本公开内容和附加权利要求自始至终，术语“a”和“the”充当单数和复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如提及“RNAi多核苷酸”包括多个此类RNAi多核苷酸，并且提及“植物”包括提及一个或多个此类植物。
[0083]术语“定向”指多核苷酸相对于参考多核苷酸的位置放置的特定顺序。线性DNA具有2个可能定向:5’_至-3’方向和3’-至-5’方向。例如，如果参考序列以5’-至-3’方向放置，并且如果第二序列以5’-至-3’方向放置在相同多核苷酸分子/链内，那么参考序列和第二序列以相同方向定向，或具有相同定向。一般地，启动子序列和在给定启动子调节下的目的基因以相同方向放置。然而，就以5’-至-3’方向放置的参考序列而言，如果第二序列以3’ -至-5’方向放置在相同多核苷酸分子/链内，那么参考序列和第二序列以反义方向定向，或具有反义定向。就彼此而言具有反义定向的2个序列可以备选地描述为具有相同定向，如果参考序列(5’_至-3’方向)和参考序列的反向互补序列(以5’-至-3’放置的参考序列)放置在相同多核苷酸分子/链内。
[0084]术语“NtHMA RNAi表达载体”指包括DNA组分的组合用于使得NtHMA RNAi构建体的转运和表达成为可能的核酸媒介物。合适的表达载体包括能够染色体外复制的附加体，例如环状、双链DNA质粒；线性化双链DNA质粒；和任何起源的其他功能上等价的表达载体。合适的NtHMA RNAi表达载体至少包括放置在上游且与NtHMA RNAi构建体可操作地连接的启动子，如下文定义的。
[0085]术语“NtHMA RNAi构建体”指编码具有RNA干扰活性的“NtHMA RNAi多核苷酸”的双链、重组DNA片段。NtHMA RNAi构建体包括与互补“正义或编码链”碱基配对的“模板链”。给定NtHMA RNAi构建体可以以2个可能的定向插入NtHMA RNAi表达载体内，就放置在NtHMA RNAi表达载体内的启动子定向而言的相同(或正义)定向或相反(或反义)定向。
[0086]术语“NtHMA RNAi多核苷酸”可以靶向NtHMA RNA用于酶促降解，涉及NtHMA RNAi多核苷酸的较小片段(“siRNA”)的形成，其可以与靶NtHMA RNA内的多个互补序列结合。一种或多种NtHMA基因的表达水平可以通过NtHMA RNAi多核苷酸的RNA干扰活性减少。
[0087]术语“模板链”指包括互补于DNA双链体的“正义或编码链”序列的序列的链，所述DNA双链体例如NtHMA基因组片段、NtHMA cDNA或NtHMA RNAi构建体、或包括可以由RNA聚合酶转录的核酸序列的任何DNA片段。在转录过程中，RNA聚合酶可以在新生RNA合成过程中以3’-至-5’方向沿着模板链移动。
[0088]术语“正义链”或“编码链”指包括互补于DNA双链体中的模板链序列的序列的链。例如，关于经鉴定的NtHMA基因组克隆的正义链的序列(“正义序列”)指定为SEQ IDNO:1。例如，关于经鉴定为克隆P6663的NtHMA cDNA的正义序列指定为SEQ ID NO:3。例如，关于经鉴定为克隆P6643的NtHMA cDNA的正义序列指定为SEQ ID NO:46。例如，如果正义链包括假定序列5’ -TAATCCGGT-3’，那么在假定靶mRNA内基本上相同的相对应序列是5，-UAAUCCG⑶-3，。
[0089]术语“反向互补序列”指互补于就正义序列而言以相同定向放置在相同链内的目的“正义序列”(例如外显子序列)的序列。例如，如果链包括假定序列5’-TAATCCGGT-3’，那么反向互补序列5’-ACCGGATTA-3’可以与正义序列可操作地连接，通过间隔物序列分开。
[0090]在RNA干扰上下文中的术语“NtHMA RNA转录物”或“NtHMA RNA”指在目的宿主植物细胞内产生的多核糖核酸分子，产生于HMA家族的内源基因的转录，包括经分离的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)。因此，这些术语包括作为转录产物由HMA相关基因产生的任何RNA种类或RNA变体，所述HMA相关基因可以不同于经分离的NtHMA基因(SEQ ID N0:1)，但在结构和/或功能水平上具有足够的相似性以分类在相同家族内。例如，如果根据所公开的方法就遗传修饰选择的宿主植物细胞是烟草，那么靶NtHMA RNA转录物包括:(I)由经分离的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)转录产生的mRNA前体和mRNA ; (2)由与经分离的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的任何基因(即与经鉴定的NtHMA基因基本上等同且编码HMA转运蛋白的相关同种型的其他不同基因)转录产生的mRNA前体和mRNA ;和(3)由NtHMA基因(SEQ ID NO:1)的等位基因转录产生的mRNA前体和mRNA。NtHMA RNA转录物包括由于特定NtHMA基因的异核RNA( “hnRNA”)的可变RNA剪接反应产生的RNA变体、起因于此类可变RNA剪接反应的mRNA变体、和任何中间RNA变体。
[0091]术语“同源性”或“同一性”或“相似性”指通过序列比对相比较的2个多肽之间或2个核酸分子之间的序列相似性程度。被比较的2个不连续核酸序列之间的同源性程度是在可比较位置上的等同或匹配核苷酸数目的函数。同一性百分比可以通过目视检查和数学计算进行测定。备选地，2个核酸序列的同一性百分比可以使用GAP计算机程序、版本6.0通过比较序列信息进行测定，所述GAP计算机程序由Devereux等人(Nuc1.Acids Res.12:387,1984)描述，且可从 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffGCG)获得。用于GAP程序的一般缺省参数包括:(I)用于核苷酸的一元比较矩阵(包含值I用于同一性和 O 用于非同一性)，以及 Gribskov 和 Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986 的加权比较矩阵，如由 Schwartz 和 Dayhoff,编辑，Atlas of Protein Sequence and Structure,Nat1nal B1medical Research Foundat1n,第 353-358 页，1979 描述的；(2)罚分 3.0 用于每个缺口和另外的0.10罚分用于每个缺口中的每个符号；和(3)对于末端缺口无罚分。备选地可以利用序列比较领域技术人员已知的各种程序。
[0092]术语“上游”指沿着线性多核苷酸序列就参考元件而言的相对方向/位置，这指示朝向多核苷酸序列的5’末端的方向/位置。“上游”可以与“参考元件的5’末端”互换使用。
[0093]术语“可操作地连接”指不同DNA元件、片段或序列的连接，以产生功能转录单位或功能表达载体。
[0094]术语“启动子”指一般放置在双链DNA片段的上游且与之可操作地连接的核酸元件/序列，所述双链DNA片段例如NtHMA RNAi构建体。例如，合适的启动子通过召募转录复合物使得NtHMA RNAi构建体的转录激活成为可能，所述转录复合物包括RNA聚合酶和各种因子，以起始RNA合成。“启动子”可以完全衍生自与目的天然基因邻近的区域，或可以由衍生自不同天然启动子的不同元件和/或合成DNA区段组成。合适的启动子包括由组织特异性因子识别的组织特异性启动子，所述组织特异性因子在不同组织或细胞类型中出现(例如，根特异性启动子、芽特异性启动子、木质部特异性启动子)、或在不同发育阶段过程中出现、或响应不同环境条件而出现。合适的启动子包括无需特异性诱导剂即可在大多数细胞类型中激活的组成型启动子。用于控制NtHMA RNAi多肽产生的合适启动子的例子包括花椰菜花叶病毒35S (CaMV/35S)、SSU、0CS、lib4、usp、STLSU B33、nos或泛素或菜豆球蛋白启动子。本领域技术人员能够产生重组启动子的多重变化，如许多参考文献中描述的，例如 Okamuro 和 Goldberg, B1chemistry of Plants,第 15 卷:第 1-82 页(1989)。
[0095]组织特异性启动子是仅在植物发育过程中的特定时间在特定细胞或组织中活跃的转录控制元件，例如在营养组织或生殖组织中。例如当多核苷酸在特定组织中的表达是优选的时，组织特异性表达可以是有利的。在发育控制下的组织特异性启动子的例子包括可以仅(或仅最初)在特定组织中起始转录的启动子，所述特定组织例如营养组织例如根或叶，或生殖组织例如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊、花或任何胚胎组织。生殖组织特异性启动子可以是例如花药特异性、胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子和种皮特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性的或其组合。
[0096]合适的叶特异性启动子包括来自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子、来自玉蜀黍的cab-mlCa+2启动子、拟南芥myb相关基因启动子(Atmyb5)、核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子(例如在叶和光生长(light-grown)幼苗中表达的烟草RBCS URBCS2和RBCS3A基因，在发育番茄果实中表达的RBCSl和RBCS2，和/或以高水平在叶片和叶鞘中的叶肉细胞中几乎专一地表达的核酮糖二磷酸羧化酶启动子)。
[0097]合适的衰老特异性启动子包括在果实催熟、叶枯萎和脱落过程中活跃的番茄启动子、编码半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍启动子。可以使用合适的花药特异性启动子。此类启动子是本领域已知的，或可以通过已知技术发现；参见例如，Bhalla和Singh(1999)Molecular control of male fertility in Brassica, Proc.1Oth Annual RapeseedCongress, Canberra, Australia ；van Tunen 等人(1990) Pollen-and anther-specific chipromoters from petunia:tandem promoter regulat1n of the chiA gene.Plant Cell2:393-40 ;Jeon 等人(1999) Isolat1n and characterizat1n of an anther-specificgene, RA8, from rice(Oryza sativa L).Plant Molecular B1logy 39:35-44;和Twell 等人(1993)Activat1n and developmental regulat1n of an Arabidopsisanther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum.Sex.Plant Reprod.6:217-224。
[0098]可以选择本领域技术人员已知的合适的根优选启动子。参见例如，Hire等人(1992) Plant Mol.B1l.20(2): 207-218 (大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和 Baumgartner (1991)Plant Cell 3 (10): 1051-1061 (在菜豆的 GRP 1.8 基因中的根特异性控制元件)；Sanger 等人(1990)Plant Mol.B1l.14(3):433-443 (根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人(1991)Plant Cell 3 (I): 11-22 (编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见Bogusz等人(1990) Plant Cell 2 (7): 633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科Parasponia andersonii和相关非固氮的非豆科山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因中分离的2种根特异性启动子。
[0099]合适的种子优选启动子包括种子特异性启动子(这些启动子在种子发育过程中活跃，例如种子储存蛋白质的启动子)和种子发芽启动子(这些启动子在种子发芽过程中活跃)。参见例如，通过引用合并入本文的Thompson等人(1989)B1Essays 10:108。此类种子优选启动子包括但不限于，Ciml (细胞分裂素诱导的信使)；cZ19Bl(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps (肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也称为Zm-40(美国专利号6, 403, 862) ;nuclc (美国专利号 6，407，315);和 celA (纤维素合酶)(参见 WO 00/11177)。Y -玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。Glob-1是胚胎特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β_菜豆球蛋白、napin、β _伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin等。对于单子叶植物,种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、g_玉米醇溶蛋白启动子、27kD.Y.-玉米醇溶蛋白启动子(例如gzw64A启动子，参见Genbank登记#S78780)、腊质基因(waxy)启动子、shrunken I启动子、shrunken2启动子、球蛋白I启动子(参见Genbank登记 #L22344)、Itp2 启动子(Kalla，等人，Plant Journal 6:849-860(1994);美国专利号5，525，716)、ciml启动子(参见美国专利号6，225，529)玉蜀黍endl和end2启动子(参见2002年12月4日提交的美国专利号6，528，704和申请10/310，191) ;nucl启动子(美国专利号6，407，315) ；Zm40启动子(美国专利号6，403，862) ；eepl和e印2 ；lecl (美国专利申请序列号09/718，754);硫氧还蛋白H启动子(美国临时专利申请60/514，123)；mlipl5启动子(美国专利号6，479，734) ；PCNA2启动子；和shrunken-2启动子。(Shaw等人，Plant Phys 98:1214-1216、1992 ;Zhong Chen 等人，PNAS US100:3525_3530、2003)。
[0100]诱导型启动子的例子包括响应病原体攻击、缺氧情况、温度升闻、光、干旱、寒冷温度或高盐浓度的启动子。病原体诱导型启动子包括来自发病机理相关蛋白质(PR蛋白质)的那些，其在受病原体感染后被诱导(例如，PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶)。参见例如，Redolfi 等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254 ;Uknes 等人(1992)Plant Cell 4:645-656 ;和 Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116。还参见1999年2月25日提交的名称为〃Inducible Maize Promoters〃的申请,美国专利申请序列号 09/257，583。
[0101]除植物启动子外，其他合适的启动子可以衍生自细菌来源(例如，章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子和衍生自Ti质粒的其他启动子)，或可以衍生自病毒启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA启动子、烟草花叶病毒的组成型启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV) 1 9S和35S启动子、或玄参花叶病毒35S启动子)。
[0102]术语“增强子”指核酸分子或核酸序列，其可以召募转录调节蛋白质例如转录激活因子，以通过增加启动子活性而增强转录激活。合适的增强子可以衍生自与目的天然启动子邻近的区域(同源来源)，或可以衍生自非天然背景(异源来源)且与NtHMA RNAi表达载体内的任何目的启动子可操作地连接，以增强启动子的活性和/或组织特异性。某些增强子可以以就转录单位定向而言的任何定向起作用。例如，增强子可以放置在转录单位的上游或下游，所述转录单位包括启动子和NtHMA RNAi构建体。本领域技术人员能够使增强子和启动子可操作地连接，以最佳化NtHMA RNAi构建体的转录水平。
[0103]B.包括编码NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi构建体的RNAi表达载体
[0104]RNA干扰(“RNAi”)或RNA沉默是可以通过其而靶向特异性mRNA用于酶促降解的进化上保守的过程。双链RNA(dsRNA)必须由细胞引入或产生(例如，dsRNA病毒或NtHMARNAi多核苷酸)，以起始RNAi途径。dsRNA可以通过RNA酶III转变为21_23bp长度的多重siRNA双链体(“siRNA”)，所述RNA酶III是dsRNA特异性核酸内切酶(“Dicer”)。siRNA随后可以由RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)识别，所述RISC通过ATP依赖性过程促进siRNA的解链。siRNA展开的反义链将激活的RISC引导至被靶向的mRNA(例如，NtHMARNA变体)，所述被靶向的mRNA包括与siRNA反义链互补的序列。被靶向的mRNA和反义链可以形成A型螺旋，并且A型螺旋的大沟可以被激活的RISC识别。靶mRNA可以被激活的RISC在由siRNA链的5’末端的结合位点限定的单个位点处切割。激活的RISC可以再循环以催化另一个切割单位。
[0105]图2A举例说明示例性NtHMA RNAi表达载体的构建。在图2A中，“S I”指构建过程的步骤I并且“S II”指步骤II。多个实施方案涉及包括编码NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，通过减少NtHMA mRNA、NtHMA mRNA前体和相关NtHMA RNA变体的表达水平来显示RNA干扰活性。表达载体包括放置在NtHMA RNAi构建体上游并且与之可操作地连接的启动子，如下文进一步定义的。NtHMA RNAi表达载体包括合适的最低限度的核心启动子，目的NtHMA RNAi构建体，上游(5’)调节区，下游(3’)调节区包括转录终止和多腺苷酸化信号，以及本领域技术人员已知的其他序列，例如各种选择标记。
[0106]NtHMA多核苷酸可以以各种形式产生，包括作为双链发夹样结构(“dsRNAi”)。NtHMA dsRNAi可以酶促转变为双链NtHMA siRNA。NtHMA siRNA双链体的链之一可以对靶NtHMA mRNA和相关NtHMA RNA变体内的互补序列退火。siRNA/mRNA双链体由RISC识别，所述RISC可以以序列依赖性方式在多重位点处切割NtHMA RNA，导致靶NtHMA mRNA和相关NtHMA RNA变体的降解。
[0107]图2B举例说明作为由示例性NtHMA RNAi构建体转录的产物形成的假定双链RNA双链体(作为“茎-环-茎”结构)的形成。在图2B中，显示了假定的NtHMA RNAi构建体10，包括3个双链DNA片段，例如片段1-3。箭头I指示RNAi构建体的形成，箭头II转录，并且箭头III dsRNA的形成。片段I放置在片段2上游并且与之可操作地连接，所述片段2放置在片段3上游并且与之可操作地连接，对于其DNA链/序列4、6和8串联连接在一起以形成链11，如所示的。备选地，NtHMA RNAi构建体包括“正义序列” 5，所述“正义序列” 5放置在“间隔物序列” 7上游并且与之可操作地连接，所述“间隔物序列” 7放置在“反向互补序列”9上游并且与之可操作地连接。链/序列5、7和9可以串联连接在一起以形成链/序列12。备选地，NtHMA RNAi构建体包括“正义序列”8，所述“正义序列”8放置在“间隔物序列”6上游并且与之可操作地连接，所述“间隔物序列”6放置在“反向互补序列”4上游并且与之可操作地连接。链/序列8、6和4可以串联连接在一起以形成链/序列11。链12与链11互补。链11是可以转录成NtHMA RNAi多核苷酸13的模板链。NtHMA RNAi多核苷酸13形成发夹(“茎-环-茎”)结构，其中茎16是起因于NtHMA RNAi多核苷酸15的分子内碱基对相互作用的互补区，并且环17代表由间隔物序列例如链/序列6或7编码的非互补区。
[0108]任何目的NtHMA RNA多核苷酸都可以通过选择用于产生NtHMA发夹双链体的合适序列组成、环尺寸和茎长度而产生。用于设计发夹双链体的茎长度的合适范围包括20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸、和600-700个核苷酸的茎长度。如果发夹双链体的茎长度是基本的，那么用于设计发夹双链体的环长度的合适范围包括4-25个核苷酸、25-50个核苷酸或更长的环长度。在特定背景下，具有长于21个核苷酸的双链体区的发夹结构可以促进有效的siRNA指导的沉默，与环序列和长度无关。
[0109]用于下调NtHMA基因(SEQ ID NO:1)和其他NtHMA相关基因的表达水平的示例性NtHMA RNAi构建体包括下述:
[0110]多个实施方案涉及包括NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，所述NtHMARNAi构建体包括下述中的一种或多种:内含子I (SEQ ID NO:4)、外显子I (SEQ ID N0:5)、内含子 2 (SEQ ID NO: 6)、外显子 2 (SEQ ID NO: 7)、内含子 3 (SEQ ID NO: 8)、外显子 3 (SEQ IDNO: 9)、内含子 4 (SEQ ID NO: 10)、外显子 4 (SEQ ID NO: 11)、内含子 5 (SEQ ID N0:12)、外显子 5 (SEQ ID NO: 13)、内含子 6 (SEQ ID NO: 14)、外显子 6 (SEQ ID NO: 15)、内含子 7 (SEQ IDNO: 16)、外显子 7 (SEQ ID NO: 17)、内含子 8 (SEQ ID NO: 18)、外显子8 (SEQ ID N0:19)、内含子9(SEQ ID NO:20)、外显子9(SEQ ID NO:21)、内含子 10(SEQ ID NO:22)、外显子 10 (SEQ IDNO: 23)、内含子 11 (SEQ ID NO: 24、外显子 11 (SEQ ID NO: 25)、和内含子 12 (SEQ ID NO: 26),其片段及其变体。
[0111]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:与选自下述的序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的 NtHMA RNAi 构建体:外显子I (SEQ ID NO:5)、外显子I (SEQ ID NO:5)的片段、外显子2 (SEQ ID NO:7)、外显子2 (SEQ ID NO:7)的片段、外显子3 (SEQ ID NO:9)、外显子3 (SEQ ID NO:9)的片段、外显子4 (SEQ ID NO: 11)、外显子4 (SEQ ID NO: 11)的片段、外显子5 (SEQ ID NO: 13)、外显子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外显子 6 (SEQ ID NO: 15)、外显子 6 (SEQ ID NO:15)的片段、外显子7 (SEQ ID NO: 17)、外显子7 (SEQ ID NO: 17)的片段、外显子8 (SEQ ID NO: 19)、外显子 8 (SEQ ID NO: 19)的片段、外显子 9 (SEQ ID NO:21)、外显子 9 (SEQ ID NO:21)的片段、外显子 10 (SEQ ID NO:23)、外显子 10 (SEQ ID NO:23)的片段、外显子 11 (SEQ ID NO:25)、和外显子11 (SEQ ID NO:25)的片段。
[0112]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:编码能够自身退火以形成发夹结构的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi构建体，其中RNAi构建体包括(a)与SEQID NO:3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第一序列；(b)编码形成发夹结构的环的NtHMA RNAi多核苷酸的间隔物元件的第二序列；和(c)以与第一序列相同的方向放置、包括第一序列的反向互补序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之间，并且第二序列与第一序列和第三序列可操作地连接。
[0113]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:编码能够自身退火以形成发夹结构的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi构建体，其中RNAi构建体包括(a)与SEQID NO:3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第一序列；(b)编码形成发夹结构的环的NtHMA RNAi多核苷酸的间隔物元件的第二序列；和(c)以与第一序列相同的方向放置、包括第一序列(SEQ ID N0:46或SEQ IDNO:48)的反向互补序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之间，并且第二序列与第一序列和第三序列可操作地连接。
[0114]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:包括与SEQ ID NO:3或SEQID NO:3的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%、98%和99%序列同一性的第一序列的NtHMA RNAi构建体。多个实施方案涉及包括NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，所述NtHMA RNAi构建体包括与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:47的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第一序列。
[0115]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:包括与选自下述的序列具有“基本相似性”，或具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第二序列的NtHMA RNAi构建体:内含子I (SEQ ID NO:4)、内含子I (SEQ IDNO:4)的片段、内含子2 (SEQ ID NO:6)、内含子2 (SEQ ID NO:6)的片段、内含子3 (SEQ IDNO:8)、内含子 3 (SEQ ID NO:8)的片段、内含子4 (SEQ ID NO: 10)、内含子4 (SEQ ID NO:10)的片段、内含子5 (SEQ ID NO: 12)、内含子5 (SEQ ID NO:12)的片段、内含子6 (SEQ ID NO:14)、内含子 6 (SEQ ID NO: 14)的片段、内含子 7 (SEQ ID NO: 16)、内含子 7 (SEQ ID NO:16)的片段、内含子8 (SEQ ID NO: 18)、内含子8 (SEQ ID NO:18)的片段、内含子9 (SEQ ID NO:20)、内含子 9 (SEQ ID NO:20)的片段、内含子 10 (SEQ ID NO:22)、内含子 10 (SEQ ID NO:
22)的片段、内含子11 (SEQ ID NO:24)、内含子11 (SEQ ID NO:24)的片段、内含子12 (SEQID NO:26)、和内含子12 (SEQ ID NO:26)的片段。备选地，可以随机产生NtHMA RNAi构建体的第二序列，而不利用衍生自NtHMA基因(SEQ ID NO: I)的内含子序列。
[0116]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:包括与SEQ ID NO:46或SEQID NO:46的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%、98%和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi构建体。多个实施方案涉及包括NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，所述NtHMA RNAi构建体包括与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第三序列。
[0117]多个实施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表达载体:包括与选自下述的反向互补序列具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi构建体:SEQ ID NO:27(外显子I)、SEQ IDNO:27(外显子I)的片段、SEQ ID NO:28 (外显子2)、SEQ ID NO:28(外显子2)的片段、SEQ ID NO:29(外显子 3)、SEQ ID NO:29(外显子 3)的片段、SEQ ID NO:30(外显子 4)、SEQ ID NO:30(外显子 4)的片段、SEQ ID NO:31 (外显子 5)、SEQ ID NO:31(外显子 5)的片段、SEQ ID NO:32(外显子 6)、SEQ ID NO:32(外显子 6)的片段、SEQ ID NO:33(外显子 7)、SEQ ID NO:33(外显子 7)的片段、SEQ ID NO:34(外显子 8)、SEQ ID NO:34(外显子8)的片段、SEQ ID NO:35(外显子9)、SEQ ID NO:35(外显子9)的片段、SEQ ID NO:36 (外显子 10), SEQ ID NO:36(外显子 10)的片段、SEQ ID NO:37 (外显子 11)、和 SEQ IDNO:37(外显子11)的片段。
[0118]多个实施方案涉及包括NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，所述NtHMARNAi构建体包括:SEQ ID NO:38( “正义序列/片段”)、包括SEQ ID NO:39的第二序列(“间隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO:40的第三序列(“反义序列/片段”)。
[0119]多个实施方案涉及包括NtHMA RNAi构建体的NtHMA RNAi表达载体，所述NtHMARNAi构建体包括:SEQ ID NO:42( “正义序列/片段”)、包括SEQ ID NO:43的第二序列(“间隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO:44的第三序列(“反义序列/片段”)。
[0120]备选地，所公开的序列可以用于构建不形成发夹结构的多种NtHMA多核苷酸。例如，NtHMA长双链RNA可以通过下述形成:(I)通过与第一个启动子可操作地连接转录NtHMAcDNA的第一条链，和(2)通过与第二个启动子可操作地连接转录NtHMA cDNA片段的第一条链的反向互补序列。NtHMA多核苷酸的每条链可以由相同表达载体进行转录，或由不同表达载体进行转录。具有RNA干扰活性的NtHMA RNA双链体可以酶促转变为siRNAs，以减少NtHMA RNA 水平。
[0121]C.通过共抑制用于减少NtHMA基因表达的表达载体
[0122]提供了通过促进NtHMA基因表达的共抑制用于减少关于NtHMA基因家族成员的内源表达水平的多种组合物和方法。共抑制现象由于将转基因的多个拷贝引入植物细胞宿主内而发生。转基因的多个拷贝的整合可以导致转基因和所靶向的内源基因的表达减少。共抑制的程度依赖于转基因和所靶向的内源基因之间的序列同一性程度。内源基因和转基因的沉默可以通过所沉默的基因座(即，内源启动子和内源目的基因)的广泛甲基化而发生，所述所沉默的基因座可以排除转录。备选地，在某些情况下，内源基因和转基因的共抑制可以通过转录后基因沉默(“PTGS”)而发生，其中可以产生转录物但增强的降解率排除转录物的累积。关于通过PTGS共抑制的机制被认为类似RNA干扰，因为RNA看起来是这些过程中的重要起始因子和靶，并且可以至少部分通过相同分子机制介导，可能通过RNA引导的mRNAs降解。
[0123]NtHMA基因家族成员的共抑制可以通过将作为转基因的NtHMA cDNA或其片段的多个拷贝整合到目的植物的基因组内来实现。宿主植物可以用表达载体进行转化，所述表达载体包括与NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子。多个实施方案涉及用于促进NtHMA家族的内源基因的共抑制的表达载体，其包括:与经鉴定为克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段，或经鉴定为克隆P6643(SEQ ID NO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子。多个实施方案涉及用于促进NtHMA家族的内源基因的共抑制的表达载体，其包括:与NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，所述NtHMA cDNA或其片段与 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0124]多个实施方案涉及通过将NtHMA cDNA或其片段的多个拷贝整合到植物基因组内，用于减少NtHMA家族的内源基因的表达水平的方法，所述方法包括:用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包括与SEQ ID NO:3或其片段；或者SEQ ID N0:47或其片段可操作地连接的启动子。多个实施方案涉及通过将NtHMA cDNA或其片段的多个拷贝整合到植物基因组内，用于减少NtHMA家族的内源基因的表达水平的方法，所述方法包括:用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包括与NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，所述 NtHMA cDNA 或其片段与 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性。
[0125]D.通过经由反义试剂抑制翻译用于减少NtHMA基因表达的表达载体
[0126]提供了通过抑制NtHMA mRNA翻译用于减少NtHMA基因家族的内源表达水平的多种组合物和方法。宿主植物细胞可以用表达载体进行转化，所述表达载体包括:与以就启动子而言的反义定向放置的NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，以使得具有与NtHMA mRNA的部分互补的序列的RNA多核苷酸的表达成为可能。用于抑制HMA mRNA翻译的多种表达载体包括:与经鉴定为克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段；或经鉴定为克隆P6643(SEQ ID NO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子；其中NtHMA cDNA或其片段以就启动子而言的反义定向放置。用于抑制HMA mRNA翻译的多种表达载体包括:与NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，所述NtHMA cDNA或其片段与SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，其中NtHMA cDNA或其片段以就启动子而言的反义定向放置。反义NtHMA RNA多核苷酸的长度可以改变，包括15-20个核苷酸、20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-75个核苷酸、75-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、和200-300个核苷酸。
[0127]多个实施方案涉及通过抑制NtHMA mRNA翻译用于减少NtHMA家族的内源基因的表达水平的方法，所述方法包括:用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包括与经鉴定为克隆P6663(SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段；或经鉴定为克隆P6643 (SEQ IDNO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，其中NtHMA cDNA或其片段以就启动子而言的反义定向放置。多个实施方案涉及通过抑制NtHMA mRNA翻译用于减少NtHMA家族的内源基因的表达水平的方法，所述方法包括:用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包括与NtHMA cDNA或其片段可操作地连接的启动子，所述NtHMA cDNA或其片段与SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，其中NtHMA cDNA或其片段以就启动子而言的反义定向放置。
[0128]E.用于减少NtHMA基因表达的其他组合物和方法
[0129]用于获得NtHMA多核苷酸和多肽的保守变体和更趋异变体的方法是本领域技术人员已知的。任何目的植物可以通过已知诱导诱变的多种方法进行遗传修饰，所述方法包括定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、化学诱导的诱变、辐射诱导的诱变和其他等价方法。例如，定点诱变在下述中描述:例如Smith(1985) "In vitro mutagenesis, 〃Αηη.Rev.Genet.19:423-462，和其中的参考文献例如 Botstein&Shortle (1985) 〃Strategies and Applicat1ns of in vitro Mutagenesis, 〃Science229:1193-1201, 和Carter (1986) "Site-directed mutagenesis, "B1chem.J.237:1-7。寡核苷酸指导的诱变在例如 Zoller&Smith(1982)"Oligonucleotide-directed Mutagenesis usingM13-derived Vectors:an Efficient and General Procedure for the Product1n ofPoint mutat1ns in any DNA Fragment, "Nucleic Acids Res.10:6487-6500 中描述。利用修饰喊基的诱变在例如Kunkel (1985) "Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesiswithout Phenotypic Select1n, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:488-492,和 Taylor 等人(1985)〃The Rapid Generat1n of Oligonucleotide-directed Mutat1ns at HighFrequency using Phosphoroth1ate-modified DNA, ^Nucl.Acids Res.13:8765-8787中描述。利用缺口双链体DNA的诱变在例如Kramer等人(1984) 〃The Gapped DuplexDNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutat1n Construct1n, 〃Nucl.AcidsRes.12:9441-9460)中描述。点错配诱变在例如 Kramer 等人(1984) "Point MismatchRepair, "Cell 38:879-887)中描述。双链断裂诱变在例如 Mandecki (1986) 〃01igonucleotide—directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli:A Method for Site-specific Mutagenesis, 〃Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:7177-7181,和 Arnold (1993)"Protein Engineering for Unusual Environments,"CurrentOpin1n in B1technology 4:450-455)中描述。利用修复缺失型宿主菌株的诱变在例如 Carter 等人(1985)"Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesisusing M13Vectors, 〃Nucl.Acids Res.13:4431-4443 中描述。通过总基因合成的诱变在例如 Nambiar 等人(1984) "Total Synthesis and Cloning of a Gene Coding forthe Ribonuclease S Protein, "Science 223: 1299-1301 中描述。DNA 改组在例如Stemmer(1994)"Rapid Evolut1n of a Protein in vitro by DNA Shuffling, "Nature370:389-391,和 Stemmer(1994)"DNA shuffling by random fragmentat1n andreassembly:1n Vitro Recombinat1n for Molecular Evolut1n, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 91:10747-10751 中描述。
[0130]备选地，NtHMA基因可以通过将转座子(和IS元件)引入目的植物的基因组内而被靶向用于失活。这些活动遗传元件可以通过有性异体受精引入，并且插入突变体可以就NtHMA活性中的丧失例如减少的Cd转运进行筛选。通过经由例如有性异体受精使亲本植物与未实施转座子诱导的诱变的植物杂交，可以将亲本植物中断裂的NtHMA基因引入其他植物内。可以利用本领域技术人员已知的任何标准育种方法。在一个实施方案中，一种或多种NtHMA相关基因可以通过插入一个或多个转座子被失活。突变可以导致一种或多种NtHMA基因的纯合断裂，一种或多种NtHMA基因的杂合断裂，或如果断裂超过一种NtHMA基因，那么纯合和杂合断裂的组合。合适的可转座元件可以选自指定为类别I和类别II的2个广泛类别。合适的类别I可转座元件包括反转录转座子、反转录子和SINE样元件。此类方法是本领域技术人员已知的，如在Kumar和Bennetzen (1999), Plant Retrotransposonsin Annual Review of Genetics 33:479 中描述的。
[0131]备选地，NtHMA基因可以通过称为 Targeting Induced Local Les1ns INGenomics ("TILLING")的方法而被靶向用于失活，所述方法使高密度点突变与突变的快速灵敏检测相组合。一般地，使植物种子暴露于诱变剂例如乙基甲磺酸(EMS)或EMS烷基化物鸟嘌呤，这一般导致错配。合适的试剂和方法是本领域技术人员已知的，如在下述中描述的:McCallum 等人，(2000), "Targeting Induced Local Les1ns IN Genomics (TILLING)for Plant Funct1nal Genomics, "Plant Phys1logy 123:439-442 ;McCallum 等人，(2000)"Targeted screening for induced mutat1ns,^Nature B1technology18:455-457 ;和 Colbert 等人，(2001) 〃High-Throughput Screening for Induced PointMutat1ns, "Plant Phys1logy 126:480-484。
[0132]备选地，NtHMA基因可以通过引入衍生自许多小环状RNA的核酶而被靶向用于失活，所述小环状RNA能够在植物中自切割和复制。这些RNA可以单独(类病毒RNAs)或与辅助病毒(卫星RNA) —起复制。合适RNA的例子包括衍生自鳄梨日斑病类病毒的那些，以及衍生自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒、和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。各种靶RNA特异性核酶是本领域技术人员已知的，如在Haseloff 等人(1988) Nature, 334:585-591 中描述的。
[0133]II1.包括NtHMA RNAi多核苷酸的转基因植物、细胞系和种子及相关方法
[0134]多个实施方案涉及通过多种方法进行遗传修饰以减少NtHMA基因表达水平的转基因植物，所述方法可以用于沉默NtHMA基因表达，并且因此产生其中NtHMA转运蛋白的表达水平可以在目的植物组织内减少的转基因植物。重金属转运的速率和重金属转运特别地镉转运的分布模式可以在根据所公开的方法和组合物产生的转基因植物中改变。适合于遗传修饰的植物包括单子叶植物和双子叶植物。
[0135]多个实施方案涉及通过本领域技术人员已知的多种方法进行遗传修饰以减少NtHMA基因表达水平的转基因烟草植物，所述方法可以用于下调NtHMA基因表达，并且因此产生其中NtHMA转运蛋白的表达水平可以在目的植物组织内减少的转基因烟草植物。已提供多种表达载体，以产生显示NtHMA基因表达水平减少的任何变种的烟草转基因品系。所公开的组合物和方法可以应用于任何目的植物物种，包括烟草属(Nicotiana)的植物，烟草属的多个物种，包括黄花烟草(N.rustica)和红花烟草(N.tabacum)(例如LAB21、LN KY17U TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1 和 Petico)。其他物种包括花烟草(N.acaulis)、尖叶肾厳(N.acuminata)、尖叶肾厳细叶变种(N.acuminatavar.multiflora)、N.africana、红猪笼草(N.alata)、N.amplexicaulis、N.arentsi1、渐狭叶烟草(N.attenuata)、N.benavidesi1、本氏烟草(N.benthamiana)、N.bigelovi1、N.bonariensis、N.cavicola、克氏烟草(N.clevelandii)、N.cordifolia、N.corymbosa、德氏烟草(N.debneyi)、N.excels1r> 福氏烟草(N.forgetiana)、N.fragrans>N.glauca、粘烟草(N.glutinosa)、N.goodspeedi1、N.gosse1、N.hybrid、N.1ngulba、N.kawakamii> N.knightiana、N.langsdorffi1、渐尖叶烟草(N.linearis)、N.longiflora、N.maritima、N.megalosiphon、N.miersi1、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.0btusifolia、N.0ccidentalism N.0ccidentalis subsp.hesperis、耳状烟草(N.0tophora)、N.paniculata、N.pauciflora、碧冬烟草(N.petun1ides)、N.plumbaginifolia、N.quadrivalvis、N.raimondi1、N.repanda、N.rosulata、N.rosulata subsp.1ngulba、N.rotundifolia、N.setchelli1、N.simulans、N.solanifolia、N.spegazzini1、斯氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、N.thyrsiflora>绒毛烟草(N.tomentosa)、拟鸾花烟草(N.tomentosiformis)、N.trigonophylla、N.umbratica、波叶烟草(N.undulata)、N.velutina、N.wigand1ides 和 N.x sanderae。用于转化的合适植物包括能够通过本领域技术人员已知转化植物的多种方法转化的任何植物组织，所述方法包括电穿孔、微粒轰击和土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转移，如例如在下述中描述的:公开了用包含Ti质粒的土壤杆菌属菌株用于转化敏感植物包括双子叶植物的方法的美国专利号4，459，355 ;公开了用土壤杆菌属载体转化木本植物的美国专利号4，795，855 ;公开了二元土壤杆菌属载体的；美国专利号4，940，838，美国专利号4，945，050 ;和美国专利号 5，015，580。
[0136]多个实施方案涉及经遗传修饰以内源表达编码NtHMA RNAi多核苷酸的RNAi构建体的转基因烟草植物，所述NtHMA RNAi多核苷酸促进NtHMA RNA转录物的降解，并且随后减少可用于翻译成NtHMA转运蛋白的RNA转录物的数目。多个实施方案涉及包括表达载体的转基因植物，所述表达载体使得根据所公开的方法产生的NtHMA多核苷酸的表达成为可能。多个实施方案涉及衍生自根据所公开的方法产生的转基因植物的细胞系。多个实施方案涉及衍生自根据所公开的方法产生的转基因植物的转基因种子。
[0137]多个实施方案涉及用于减少植物中的NtHMA基因表达水平的方法，所述方法包括减少NtHMA基因的表达水平，这可以通过本领域技术人员已知的多种方法来完成。作为例子，本公开内容描述了:(1)通过表达NtHMA RNAi多核苷酸，用于减少可用于翻译的内源NtHMA RNA变体的稳态水平的RNA干扰方法；(2)通过将作为转基因的NtHMA cDNA或其片段的多个拷贝整合到植物基因组内，用于减少一种或多种NtHMA基因转录的共抑制方法；
(3)通过表达反义多核苷酸用于减少NtHMA翻译的反义方法，所述反义多核苷酸可以靶向NtHMA RNA;和⑷用于诱导诱变的多种方法。
[0138]多个实施方案涉及这样的转基因烟草植物，其通过本领域技术人员已知的多种方法进行遗传修饰以减少NtHMA基因表达水平，并且进一步进行修饰以减少第二种目的内源基因(即非NtHMA相关的)的表达，或增强目的外源基因(即非NtHMA相关的)的表达。例如，编码涉及生物碱生物合成的酶的第二种目的内源基因的下调可能是希望的。在其他情况下，编码目的重组蛋白质例如用于治疗用途的人激素的转基因的表达水平中的增强可能是希望的。本领域技术人员能够产生多种转基因植物，其可以进行修饰例如以外源表达NtHMA RNAi多核苷酸和至少一种目的重组基因产物例如重组人生长因子，或可以靶向与NtHMA家族不相关的第二种目的基因的RNAi多核苷酸。
[0139]根据所公开的方法产生转基因植物提供了许多优点。转基因植物包括转基因烟草植物可以在包含可变Cd浓度的土壤中或在包含小于所需Cd浓度的土壤中生长。这些转基因植物和衍生种子可以提供用于在更广泛范围的土壤环境中培养它们的更多选择，这可以增加从业者(例如农民)可获得的可培养土壤量。此外，与非转基因对应物相比较，显示减少的Cd含量的这些转基因植物可以直接作为可食用产物而消费。与非转基因对应物的消费相比较，这些转基因植物的可食用部分的消费可以是更健康的选择。可以根据所公开的方法遗传修饰的合适植物包括可用于农业用途培养的植物，包括水稻、玉米、南瓜、大豆、莴苣、马铃薯、beats、药草、小麦、大麦、胡萝卜等。当与非转基因对应物相比较时，这些转基因植物包括叶片部分中的Cd减少％可以是大约至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%和99%。这些转基因植物包括叶片部分中的Cd含量是来自下述范围的值:约0.01至约 0.05ppm、约 0.01 至约 0.lppm、约 0.01 至约 0.5ppm、约 0.01 至约 1.0ppm、和约 0.01 至约 δρρη?ο
[0140]IV.并入经遗传修饰以包含减少的Cd含量的烟草叶的消费品
[0141]多个实施方案提供了转基因植物，其中NtHMA基因家族成员的表达水平基本上减少，以减少或阻碍Cd转移到叶片内。衍生自根据所公开的方法产生的转基因烟草植物的叶片可以并入包含Cd的多种消费品内，所述Cd处于基本上低于通过将衍生自相同基因型的植物的烟草叶制备的消费品的那种的水平，所述衍生自相同基因型的植物在相同条件下生长，但未就NtHMA基因家族成员的表达水平减少而言进行遗传修饰(“非转基因对应物”)。
[0142]在某些实施方案中，与非基因组对应物相比较显示减少的Cd含量的这些转基因植物可以并入消费品内，包括各种可抽吸物品例如雪茄烟、香烟和无烟烟草产品(即不可燃的)。与非转基因对应物相比较，通过并入衍生自烟草植物的烟草叶产生的可抽吸物品和无烟烟草产品可以提供更健康的选择，所述烟草植物根据所公开的方法进行遗传修饰以包含减少的Cd水平。
[0143]并入根据所公开的方法进行遗传修饰的烟草植物的无烟烟草产品可以以适合于消费者的口腔舒适的任何形式制造。无烟烟草产品包含以任何形式的烟草，包括作为沉积、混合、围绕或以其他方式与以任何形式(例如薄片、薄膜、片剂、泡沫或珠)的其他成分相组合的干燥颗粒、碎屑、粒剂、粉剂或浆(即烟草提取物)。无烟烟草产品可以用材料进行包装，所述材料可以是可食用(即，经口崩解的)或不可食用的。无烟烟草产品的液体内含物可以以例如珠的形式封装，以排除与水溶性包装物的相互作用。包装物可以作为小袋成形，以部分或完全封装并入烟草的组合物，或充当粘合剂以使烟草的多个片剂、珠或薄片保持在一起。包装物也可以封装可塑烟草组合物，其适应消费者的口的形状。经口崩解的包装物可以封装无烟烟草，例如作为干鼻烟或可溶烟草，并且可以在连续热压成形或水平形式/填充/密封设备或使用可食用薄膜(其可以包含或不包含烟草)的其他合适的包装设备上成型。用于构建包装物的示例性材料包括薄膜组合物，包括HPMC、CMC、果胶、海藻酸盐、支链淀粉和其他商购可得的可食用薄膜成型聚合物。其他包装材料可以包括由明胶、HPMCdg粉/角叉菜胶或其他商购可得材料产生的预成型的胶囊。此类包装材料可以包括烟草作为成分。无法经口崩解的包装物可以由针织或非针织编织物(nonwoven fabrics)、涂层或无涂层纸、或穿孔或其他多孔塑料薄膜组成。包装物可以并入调味剂和/或着色剂。无烟产品可以利用商业包装领域技术人员已知的任何方法与包装物装配在一起，包括诸如泡罩包装和stik-包装方法，其中小包装可以通过垂直形式/填充/密封包装机器成型。
[0144]当与衍生自非转基因对应物的消费品相比较时，通过并入衍生自经遗传修饰以包含减少的Cd水平的烟草植物的烟草叶产生的、这些可抽吸物品和无烟产品中的Cd减少％是至少约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的值。在某些实施方案中，通过并入衍生自经遗传修饰以包含减少的Cd水平的烟草植物的烟草叶产生的、这些可抽吸物品和无烟产品中的Cd含量是来自下述范围的值:约0.01至约0.05ppm、约0.01至约 0.lppm、约 0.01 至约 0.5ppm、约 0.01 至约 1.0ppm、和约 0.01 至约 5ppm。
[0145]植物中的Cd累积程度可以依赖于归于基因型复杂度和生长环境的几种参数而基本上不同。例如，田间生长的烟草叶中的Cd浓度可以依赖于诸如农业气候、土壤参数和栽培变种的因素而极端不同。此外，在烟草植物的不同部分内的相对Cd分布模式可以根据物种、器官/组织和生长条件(即田间生长与水耕法生长比较)而改变。平均起来，在田间生长的烟草叶(包括中脉和叶脉)中测量的Cd浓度可以在约0.5至5ppm (百万分之，或ug/g烟草干重)的范围内。然而，许多公开的Cd水平一般不限定烟草成熟阶段、烟草变种或收获用于分析的特定叶部分(即从叶柄位置切除)。在某些变种中，较低的叶可能累积比中部和较高的叶更高的Cd水平。在细胞内水平上，Cd可以在植物细胞的各种细胞组分中发现，包括细胞壁、细胞质、叶绿体、核和液泡。
[0146]此外，在烟草叶中测量的Cd含量可以依赖于其中烟草植物所生长的土壤环境中的Cd水平而基本上改变。与在非污染区中生长的遗传上等同的对应物的叶相比较(其可以累积约0.4至约Sppm的Cd)，在Cd污染区中生长的烟草的叶可以累积约35ppm或更高的Cd。在Cd污染区中生长的植物的叶内的液泡可以累积极高的Cd浓度。用于修饰所公开的组合物以适合于给定目的植物物种的方法是本领域技术人员已知的。
实施例
[0147]实施例1
[0148]全长烟草属NtHMA基因组克隆的克隆和外显子作图
[0149]独立地鉴定了代表内源NtHMA基因的不同部分的2个部分基因组克隆，称为“CH0_0F96xf01.abl”和“CH0_0F261xo09cl.abl”。基于得自部分基因组克隆的序列信息，随后鉴定了全长基因组克隆(_H0-18-2)和4个全长NtHMA cDNA，包括克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)和克隆P6643(SEQ ID N0:47)。绘制了全长基因组克隆(_Η0_18_2) (17，921bp)的外显子和内含子亚区的图。如图1中所示，从烟草属中克隆的全长内源NtHMA基因包括由总共3392个核苷酸组成的11个外显子。
[0150]实施例2
[0151]编码RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi表达载体PBI121-NtHMA (660-915)的构建
[0152]表1提供了对经分离的NtHMA基因组克隆(SEQ ID NO: I)内的每个外显子作图的核苷酸位置列表。
[0153]表1

【权利要求】
1.用于减少植物的至少部分中的Cd水平的方法，包括通过减少重金属ATP酶(HMA)基因表达和/或HMA基因产物活性来修饰所述植物，其中所述修饰或未修饰形式的HMA基因选自: 包括这样的序列或由这样的序列组成且编码具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白的基因，所述序列与SEQ ID NO:1具有至少70%序列同一性； 包括这样的序列或由这样的序列组成的基因，所述序列与SEQ ID NO:3具有至少70%序列同一性； 包括这样的序列或由这样的序列组成的基因，所述序列与SEQ ID NO:47具有至少70%序列同一性； 包括编码这样的多肽的序列或由编码这样的多肽的序列组成的基因，所述多肽与SEQID NO:2具有至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白；和 包括编码这样的多肽的序列或由编码这样的多肽的序列组成的基因，所述多肽与SEQID NO:49具有至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA转运蛋白。
2.用于减少植物的至少部分中的Cd水平的方法，包括减少植物中重金属ATP酶(HMA)基因表达和/或HMA基因产物活性，其中所述修饰或未修饰形式的HMA基因编码与SEQ IDNO:2或49具有至少70%序列同一性或至少95%序列同一性的多肽，并且其中所述多肽具有PlB型ATP酶活性。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中减少HMA基因表达和/或HMA基因产物活性是通过对HMA基因的诱变的修饰而实现的。
4.权利要求3的方法，其中对HMA基因的诱变是通过定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、化学诱导的诱变或辐射诱导的诱变而实现的。
5.权利要求1或权利要求2的方法，其中减少HMA基因表达和/或HMA基因产物活性是通过对HMA基因的失活的修饰而实现的。
6.权利要求5的方法，其中失活是通过将转座子和/或插入序列(IS)元件引入植物的基因组内、通过Targeting Induced Local Les1ns IN Genomics ("TILLING")或通过引入靶RNA特异性核酶而实现的。
7.权利要求1或权利要求2的方法，其中减少HMA基因表达和/或HMA基因产物活性是通过引起RNAi构建体的表达而减少所述植物中的NtHMA mRNA水平而实现的。
8.权利要求7的方法，其中所述RNAi构建体包括: 与SEQ ID NO:3或47的部分具有至少90%序列同一性的第一序列； 第二序列；和 以与所述第一序列相同的定向放置、具有所述第一序列的反向互补序列的第三序列， 其中所述第二序列放置在所述第一序列和所述第三序列之间，并且所述第二序列与所述第一序列和所述第三序列可操作地连接。
9.上述权利要求中任一项的方法，还包括在修饰植物之后，就减少的HMA基因表达和/或HMA基因产物活性进行筛选的步骤。
10.权利要求9的方法，包括就减少的Cd转运和/或降低的Cd水平进行筛选。
11.上述权利要求中任一项的方法，其中所述植物是烟草。
12.根据权利要求1一 11中任一项获得的或可获得的修饰的植物，并且由于重金属ATP酶(HMA)基因表达和/或HMA基因产物活性的减少，与未修饰的植物的部分相比，所述修饰的植物在其至少部分中具有降低的Cd水平。
13.权利要求12的修饰的植物，其中叶具有降低的Cd水平。
14.权利要求12或权利要求13的修饰的植物，其中所述植物是烟草。
15.可消费烟草产品，其并入从权利要求14的修饰的植物中收获的叶，其中由于重金属ATP酶(HMA)基因表达和/或HMA基因产物活性的减少，与未修饰的植物的叶相比，所述叶具有降低的Cd水平。
16.权利要求15的产品，其中Cd减少％是至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的值。
17.权利要求13或权利要求14的产品，其中所述Cd含量是约0.01至约0.05ppm、约.0.01至约0.lppm、约0.01至约0.5ppm、约0.01至约1.0ppm、或约0.01至约5ppm的值。
【文档编号】C12N15/82GK104131030SQ201410370663
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2008年12月11日 优先权日:2007年12月13日
【发明者】A·哈耶斯, C·库蒂斯普迪, R·范德霍文 申请人:菲利普莫里斯生产公司