专利名称：一种降低镉在植物中积累的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种降低重金属在植物中积累的方法及其应用，特别涉及一种降低镉在植物中积累的方法及其应用。
背景技术：
工业革命以来，全球有毒重金属的污染急速加剧，其中重金属镉是最严重的环境污染物之一，每年有15000吨镉被生产出来，用于电池、合金和染料。慢性暴露于镉污染的环境能引起肾脏及骨骼的损害，还存在引发癌症的危险。2003年8月Nature-Medicine发表的一项研究提出微量镉有模拟雌激素的作用，即使相当低的剂量也将对身体造成大范围的影响，可能诱发子宫癌和乳癌(Johnson MD，Kenney N，Stoica A，Hilakivi-Clarke L，Singh B，Chepko G，Clarke R，Sholler PF，LirioAA，Foss C，Reiter R，Trock B，Paik S & Martin MB.Cadmium mimics the in vivoeffects of estrogen in the uterus and mammary gland.Nature Medicine，2003.91081-1084)。据估计，仅在美国，用传统的方法清除有毒重金属污染需要花费至少2000亿美元。近年发展的植物修复技术可以利用植物对重金属的富集作用清除和减低重金属对环境的污染，该技术操作方便，费用低廉，而且对于化学方法无力对付的大范围低浓度的污染有着很好的治理作用(Prasad，M.N.V and Freitas，H.M.O.Feasible biotechnological and bioremediation strategies for serpentine soilsand mine spoils.EJB Electronic J.Biotechnology，1999.236-50)。但是，目前所知的重金属超富集植物甚少，而且往往生物量小、富集效率低且对其生长习性不了解，这些都限制了植物修复技术在实际中的应用。在重金属富集植物的种植过程中如何通过简便而廉价的方法提高其对重金属的富集效率还没有报道。
目前，城市垃圾、污水、污泥等用于农业生产的数量愈来愈多，尤其是用于城市郊区农业生产的更多。一方面缓和了肥、水紧缺的矛盾，为农业生产的增产增收做出了贡献；另一方面则给土壤和农作物带来了不同程度的重金属污染，直接或间接地影响农作物的产量与品质，并通过食物链进入人体危害人民的健康。尤其是城市近郊区和工矿企业附近的蔬菜重金属污染愈来愈严重。菜园土壤随种菜历史的延长，熟化程度的增加以及城市工业的污染，重金属的含量有明显增高的趋势，其中部分蔬菜的重金属含量已超过了食品卫生标准。
蔬菜是广大人民日常生活中不可缺少的食物，蔬菜的重金属含量直接关系到人们的身体健康。土壤污染对蔬菜影响较大的有镉污染、汞污染、铬污染和砷污染，其中以镉污染尤为严重。Martin等最新的研究发现在世界卫生组织推荐的一周安全剂量(每周每公斤体重7微克)范围内，镉已经能产生雌激素效应(Johnson MD，KenneyN，Stoica A，Hilakivi-Clarke L，Singh B，Chepko G，Clarke R，Sholler PF，LirioAA，Foss C，Reiter R，Trock B，Paik S & Martin MB.Cadmium mimics the in vivoeffects of estrogen in the uterus and mammary gland.Nature Medic ine.2003.91081-1084)。
稀土元素镧可提高植物对不良环境的适应能力或增加对逆境的抗性，如低温、高温、干旱和盐渍等。另有研究表明，稀土元素能减轻重金属铅对植物的伤害作用(庞欣，王东红，彭安，镧对铅胁迫下小麦幼苗抗氧化酶活性的影响.环境化学，2002，21(4)318-323)。面对目前土壤重金属污染在相当长的一段时间尚不能完全清除的现实，当务之急便是研究如何降低蔬菜中重金属积累的技术。蔬菜对重金属吸收、积累和解毒的机制较为复杂，有人通过植物生理学研究推测外加镧可缓解重金属对植物的毒性(庞欣，王东红，彭安，镧对铅胁迫下小麦幼苗抗氧化酶活性的影响.环境化学，2002，21(4)318-323；张家荣，顾月华，赵贵文，稀土浸种对油菜种子萌发及种苗生长的生物效应.稀土，1999，30(3)55-57；周青，黄晓华，黄钢业等，La对Pb伤害大豆幼苗的影响，应用与环境生物学报，1999，5(1)22--25)。最近的研究表明，植物络合素及植物络合素合酶基因在蔬菜对重金属的耐受机制中起着极其重要的作用。但有关镧与该基因的表达及植物重金属积累的关系国内外尚无报道。
发明创造内容本发明的目的是提供一种降低镉在植物中积累的方法及其应用。
本发明所提供的降低镉在植物中积累的方法是在含镉的植物生长介质中施加三价镧离子。
所述植物可为农作物，蔬菜，观赏植物，树木等，优选为蔬菜，尤其为叶菜类蔬菜，特别是十字花科的叶菜，最优选为生菜。三价镧离子可以来自La(NO3)3、La(Ac)3、LaCl3或以上述成份为主的稀土微肥，优选为La(NO3)3。三价镧离子的浓度为0.02-0.06mg/L或0.02-0.06mg/kg生长介质，优选为0.04mg/L或0.04mg/kg植物生长介质。植物生长介质可为土壤，沙子，铚石等任何可适合植物生长的物质。
本发明的方法有效地降低了植物对镉的积累。生菜幼苗在镉胁迫下施加0.04mg/L硝酸镧后，三价镧离子可以抑制生菜对有害重金属镉的积累，特别是在蔬菜茎叶中的积累。已有的研究表明镧在施用临界值30mg/kg耕作土时，对环境和动物都是安全无害的，而本发明中施加的镉浓度远低于该临界值。本发明的方法可广泛用于生产低镉农作物。
图1A为不同处理条件下生菜种子的萌发照片图1B为不同处理生菜芽的鲜重、根长及茎长统计直方2为镧对镉胁迫下生长20天的生菜鲜重、根长及茎长的影响直方3A为经不同处理后生菜根中镉的含量直方3B为经不同处理后生菜茎叶中镉的含量直方4为LsPCS1片段核苷酸序列及编码氨基酸序列图5A生菜茎叶RT-PCR电泳5B生菜根RT-PCR电泳6A为镧对镉胁迫下的生菜叶中植物络合素合酶基因表达的影响直方6B为镧对镉胁迫下的生菜根中植物络合素合酶基因表达的影响直方图具体实施方式
材料1、植物材料和质粒所用的植物材料为美国结球生菜(Lactuca sativa)；主要试剂均为进口或国产分析纯试剂。克隆载体pGEM-TEasy购自Promega公司。
2、主要生化试剂及酶类限制性核酸内切酶、DNA分子量参照物购自华美生物工程公司；DNA回收试剂盒购至上海申友生物技术公司；Taq酶、dNTPs和RT-PCR kit购自Takara公司；X-Gal、IPTG购自Promega公司；SuperScript II反转录酶购自Invitrogenn公司。
实施例1、镧对镉胁迫下的生菜种子萌发的影响将生菜种子用70％乙醇浸泡30秒，0.1％HgCl2水溶液浸泡10分钟，然后用无菌水冲洗5次，将种子点种于垫有滤纸的平皿中，滴加不同处理的溶液(处理及代码见表1)28℃暗处萌发。5天后，采收幼苗、冲洗后吸干水分，称其鲜重，测量其根及茎的长度。
表1、各种处理及处理浓度代码 处理 处理浓度CK 对照 ——La 镧处理 0.04mg/L La(NO3)3
Cd 镉处理 0.05mM CdCl2Cd+La 镉镧处理 0.05mM CdCl2+0.04mg/L La(NO3)3生菜种子于0.05mM CdCl2胁迫下萌发5天后，与正常条件下的种子相比，幼芽鲜重减少、根长和茎长降低，其中最明显的变化是对根生长的抑制。结果如图1A和图1B所示，表明同时外加0.04mg/L La(NO3)3，生菜的根明显比仅以镉处理的根长，说明三价镧离子在一定程度上对镉的毒性有拮抗作用；在鲜重、茎长方面，镧离子也在一定程度上减缓了镉的毒性。
实施例2、镧对镉胁迫下的生菜植株生长的影响生菜(Lactuca sativa)种子按照步骤1中的杀菌方法处理后在洗净的石英砂中发芽出苗，10天后取生长一致的幼苗，清洗干净，移于塑料钵中，每钵盛4/5体积洗净的沙子，营养物质1/2MS(CaCl2free)培养基以溶液的方式加入到沙子中，在温室内进行培养，光周期16/8h，培养温度25℃。植株生长20天后开始处理。试验设6个处理，各处理中镉离子和镧离子的浓度见表2。每个处理分别于1h，2h，6h，12h，24h，48h和96h分7次取样，分别采集根和茎叶，每个样品备四份。其中一份用于测定镉含量。
表2、各种处理及处理浓度代码 处理 处理浓度CK 对照 ——La 镧处理 0.04mg/L La(NO3)3Cd 镉处理 0.5mM CdCl2Cd+La 镉镧处理 0.5mM CdCl2+0.04mg/L La(NO3)3在镉胁迫下，生菜植株最明显的中毒症状是叶片萎蔫失绿，生长缓慢甚至停滞。但同时加入镧在很大程度上可以缓解镉的毒性，植株未见明显的萎蔫。结果如图2所示，表明在镉胁迫下，镉处理的植株与对照植株相比鲜重、根长及茎长均显著下降，而镉镧处理的植株鲜重、根长及茎长只有很小幅度的降低。说明外加三价镧离子可提高生菜对重金属镉的耐受性。
实施例3、施加镧对镉胁迫下生菜中镉累积的效应将实施例2中用于测定镉含量的生菜根和茎叶用去离子水洗净后，105℃下杀青，65℃下烘干。样品粉碎后，称取适量，加3ml硝酸于微波消解仪中消解15min，消解后定容至25ml容量瓶中，用石墨炉原子吸收分光光度计测定镉含量(镉波长228.8nm)。
结果如图3A和图3B所示，表明对照和仅外加镧的生菜植株中镉含量几乎为零。在营养液中加镉，生菜植株中镉含量便显著增加，且根中镉含量明显比茎叶中高；并且随着时间的延长，生菜根和茎叶中的镉的含量增加。但是Cd+La处理的生菜中镉的含量明显低于Cd处理。其中当镉胁迫12h时，根和茎叶中镉含量分别为205.8μg/gDW和165.8μg/g DW；在镉胁迫的同时加入三价镧离子，生菜根和茎叶中镉含量为185.1μg/g DW和73.8μg/g DW，分别降低至89.9％和44.5％。镉胁迫96h时，生菜根和茎叶中镉含量分别为709.7μg/g DW和416.8μg/g DW；在镉胁迫的同时加入三价镧离子，生菜根和茎叶中镉含量为556.6μg/g DW和255.6μg/g DW，分别降低至78.4％和53.7％。说明施加三价镧离子在提高了生菜对重金属镉耐受性的同时降低了其对镉的吸收和积累。
实施例4、镧作用的分子机理1、LsPCS1片段的克隆及测序(1)生菜总DNA的制备提取缓冲液5ml Tris(1M，pH 8.0)，5ml EDTA(0.5M，pH 8.0)，6.25mlNaCl(4M)，3.3ml 20％SDS，1.180 β-Mecapto ethanol，定容至50ml。
取0.2g生菜全株于液氮中研成粉状，加入800μl提取缓冲液(65℃)剧烈震荡混匀，65℃水浴20分钟，每5分钟混匀一次。加250μl 5 M KAc(预冷)，迅速颠倒混匀置于冰上5分钟。4℃，12000rpm，离心5min，上清液转入新管，4℃，12000rpm，离心5min，彻底去沉淀。上清转入含600μl异丙醇的离心管，颠倒混匀至少10次(RNA沉淀)。4℃，12000rpm离心15min后，去上清。加入500μl去离子水溶解沉淀，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，4℃，12000rpm离心5min，上清用2倍体积乙醇沉淀。加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，用吸水纸吸干。加入适量Milli-Q水，温和振荡至完全溶解，进行紫外分析测定。
(2)LsPCS1片段的克隆根据已经克隆的拟南芥、大豆、油菜等的植物络合素合酶基因的cDNA序列比较结果，在保守区设计简并引物，上游引物和下游引物分别为5’-TGGAAGGG(AGCT)CC(CT)TGGAG(AGCT)TGG-3’，5’-TGCCGTCGCAG(A/G)TGCA(G/A)(T/A)ACCT-3’用生菜的总DNA作为模板，进行PCR扩增，在20μL的反应体系中依次加入模板DNA约10ng，10×PCR缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTP2μl，20mmol/L上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶1U，在MJ Research公司生产的PTC200型扩增仪上进行PCR扩增。反应条件为95℃预变性5min，每次循环94℃变性30sec，60℃退火30min，72℃延伸1min，共30次循环，最后72℃再延伸10min。总DNA扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测，并用GDS 8000凝胶图像分析系统照像记录。
(3)特异扩增片段的回收和克隆测序特异扩增片段经低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收、纯化，按常规方法克隆到pGEM-TEasy载体上，并转化E.coli DH5α，蓝白斑筛选后，进行EcoR I酶切鉴定，PCR鉴定，菌株送到上海申友生物技术公司测序。结果如图4所示，表明从生菜基因组DNA中扩增出一个片断，测序结果表明，大小为421bp，编码115个氨基酸，在GenBank中进行同源性比较结果表明，该片段与其他植物络合素合酶基因同源性达85％，其中包含一个76bp的内含子。将该片段命名为LsPCS1，并在GenBank注册(Accession No.AF506283，核苷酸序列及推测的蛋白序列见图4)。
2、镧对镉胁迫下的生菜植物络合素合酶基因表达的影响(1)生菜幼苗叶、根总RNA的抽提采用TRIZOL总RNA抽提试剂盒(GIBCOBRL公司产品)抽提生菜幼苗叶、根的总RNA。设置CK、La、Cd、Cd+La(CdCl20.5mM、La(NO3)30.04mg/L)4个处理，分别于1h、2h、6h、12h、24h、48h后采收样品，提取茎叶和根中的RNA进行半定量RT-PCR检测。称取组织0.1mg放入用液氮预冷过的碾钵中，在液氮中研磨至粉末状，转至匀浆管加入RNA extraction buffer 1ml。将匀浆管插于冰上，静止冰浴20分钟。加入等体积酚氯仿溶液，用力震荡1分钟，冰浴20分钟。4℃，12000rpm，离心20min。从每管中吸取上清至另一离心管。分别加入1/10体积3mol/l NaAc(pH4.5)，加入等体积酸性酚氯仿溶液，用力震荡离心管1分钟，冰浴20分钟。4℃，12000rpm，离心20min。从每管中吸取上清至另一离心管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后沉淀。4C，12000rpm离心20min后，去上清。加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，用吸水纸吸干。加入25μl Milli-Q水，温和振荡至完全溶解，进行紫外分析测定。将RNA置于-20℃保存备用。
(2)RT-PCR检测LsPCS1的表达量①不同处理cDNA的合成按下列成份合成反转录2×mRNA Selective PCR Buffer 25μl，MgCl210μl，
dNTP/相似物混合物 5μl，RNase抑制剂 1μl，AMV反转录酶 1μl，下游特异引物 1μl，样品RNA 1μg，ddH2O6μl。
按以下条件进行反转录反应30℃ 10min，45℃ 30min，5℃ 5min。
②生菜actin基因片段的克隆根据拟南芥等双子叶植物actin基因的保守区设计一对简并引物上游，5’-TTTGCTGGAGATGATGCTCC-3’，下游，5’-GTGGTACGACCACTGGCATA-3’，以生菜对照cDNA为模板，进行PCR扩增，得到一条400bp左右大小的条带，经过回收、连接、测序、比较，证明同双子叶植物的actin基因具有极高的同源性，是生菜的actin基因片段。actin基因的表达比较稳定，不因外界环境刺激或组织不同而变化，在RT-PCR中作为内参。
③PCR反应根据LsPCS的序列，设计一对特异引物上游，5’-GCTTGACTGTTGCGAGCCTTTG-3’下游5’-ATCAATGCCATGTCCCTTCCAGCA-3’以不同处理的cDNA为模板，按以下程序进行95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 50秒，23个循环。PCR均设置了相应的正负对照，即以总DNA为模板作为PCR正对照，以不加模板作为负对照。结果如图5A和图5B所示，表明以合成的第一链cDNA作为模板，特异引物扩增出一条300bp左右的条带。
取等量的PCR产物进行电泳，经Alphaimager扫描并利用BiolD对各个泳道的条带进行积分。同法测定对应的actin基因表达量，并将两者进行比较，对生菜茎叶和根中LsPCS1的表达情况进行了分析。结果如图6A和图6B所示，表明对照植株茎叶和根中LsPCS1的转录水平均较低；在重金属镉胁迫下，LsPCS1的转录水平明显升高，而且根中LsPCS1 mRNA积累的速度和量均较茎叶中高。这与植株中镉积累的趋势相似。在镉胁迫的同时加入三价镧离子后，LsPCS1的表达量更高；特别是在处理24小时的根中，LsPCS1的表达量为对照的6.4倍，镉胁迫的1.7倍；但相应的镉的积累却下降为镉胁迫的57％。这表明三价镧离子可能是通过促进在重金属解毒中起重要作用的植物络合素合酶基因的表达来降低重金属对植物的毒害的，其结果表现为植物对重金属的抗性提高而积累降低。
权利要求
1.一种降低镉在植物中积累的方法，是在含镉的植物生长介质中施加三价镧离子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物为农作物，蔬菜，观赏植物，树木。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物为蔬菜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述植物为生菜。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述三价镧离子来自La(NO3)3，La(Ac)3或LaCl3或以上述成份为主的稀土微肥。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述三价镧离子为La(NO3)3。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述三价镧离子的浓度为0.02-0.06mg/L或0.02-0.06mg/kg生长介质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述三价镧离子的浓度为0.04mg/L或0.04mg/kg植物生长介质。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物生长介质为土壤，沙子或铚石。
10.权利要求1所述的方法在生产低镉植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种降低镉在植物中积累的方法及其应用。其目的是提高植物对镉的耐受性并降低镉在植物中的积累。本发明所提供的降低镉在植物中积累的方法是在含镉的植物生长介质中施加三价镧离子。本发明的方法可广泛用于生产低镉农作物。
文档编号A01N59/16GK1596657SQ0315719
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者麻密, 何振艳, 李江川, 张海燕 申请人:中国科学院植物研究所