一种水稻水淹诱导型组织特异性表达启动子Possub5及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻水淹诱导型组织特异性启动子possub5的克隆及其在转基因水稻中的应用。

背景技术：

水稻作为人类最重要的粮食作物之一，在包括亚洲、非洲和拉丁美洲的大部分地区都有种植。然而水稻生长地区常高温多雨，淹涝已成为影响水稻产量的主要自然灾害之一。在淹水条件下，淹水深度、时间、水温、水质的酸碱性、水的流动性和浑浊度等都会对水稻生长造成影响。水稻属于一种半水生植物，可以耐受一定的水淹环境。有些水稻可以靠通过改变形态及结构上的一些特性来适应水淹环境，如使其茎、叶、叶柄快速伸长到空气中，提高植株的水下部分的光合作用及代谢。在洪水较深时，水稻则倾向于采取另一方式来适应洪水，即抑制植株在水下生长，保持能量及其碳水化合物平衡。已有的研究证据表明赤霉素、脱落酸和乙烯参与了水稻的耐受水淹的信号转导途径。赤霉素存在于植物幼芽、幼根、胚等组织中，能促进植物的节间伸长，解除种子、块茎和芽的休眠。在水淹环境下会积累大量的乙烯，可减弱脱落酸活性，而脱落酸活性的减弱会增强赤霉素的活性，从而调节植物茎叶细胞的伸长。但并不是所有的水稻都能在洪水环境中生存，因此，研究水稻的耐淹机制对提高水稻的品质和产量就有重要的推动作用。通过基因工程等方法，开发受水淹诱导启动子，以期通过植物遗传工程培育耐淹高产的水稻品种已成为当前一项急需解决的任务。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种水淹诱导型启动子，利用该启动子能启动外源基因在水稻受淹条件下表达。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻水淹诱导型启动子possub5，该启动子为seqidno:1所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供一组扩增水稻根特异表达启动子的全部或其任意片段的引物对，该引物对的核苷酸序列分别如seqidno：2和seqidno：3所示。

另一方面，本发明还提供一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的水稻根表达启动子序列得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达基因序列的上游。在一种实现方式中，所述待表达的基因为gus基因。该重组表达载体为将seqidno:1所示的序列即possub5或启动子possub5。构建于pcambia1381中得到的重组表达载体，本文中称为pcambia1381-possub5。或者待表达基因可以为任何对水稻根组织具有改善功能的基因。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻根表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻根表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

利用本发明的possub5启动子驱动gus基因在水稻中表达，gus染色检测结果显示只在根部有明显的蓝色，表明该启动子是一个根特异表达的启动子，能调控基因特异性表达于根中。本发明的启动子在水淹条件下，能够诱导gus基因，由此表明，本发明的启动子possub5是一个水淹诱导的启动子。综上所述，本发明的启动子possub5是一个具有根组织表达、受水淹诱导的启动子。换言之，本发明的启动子具有双重特异性，即根特异性和水淹诱导特异性，这样的双重特异性启动子是非常少见的，并且由于其双重特异性又都是非常有利于水稻耐水淹特性的，因此，发现并利用该启动子意义重大。

进一步地，所述应用用于改良植物生长特性，一方面可以用于根部的生长及改良，另一方面用于提高植物在水淹条件下的生长能力，从而培育理想的植物品种。

本发明技术人员应当理解根据seqidno:1第1-1862位所示的核苷酸序列，对其替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列；与所述水稻水淹诱导型组织特异性启动子possub5的dna序列有至少80％同源性的dna序列；或者，所述启动子还包括在高严谨条件下可与seqidno：1所示的核苷酸序列杂交、且具有启动子功能的核苷酸序列，都属于本发明内容。

技术效果

1、本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻中驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带来的物质能量浪费，有效改良水稻的特性，在实际应用中具有显著价值。

2、通过该启动子驱动目标基因在植株根尖中表达，可以增强根发育过程中对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等；或提高根部抵抗害虫的能力。

3、通过该启动子在植株没有被水淹的情况下，能够驱动促进根生长的基因，或驱动激素调节基因，或代谢途径中的相关基因，促进根部的生长发育，而且在水淹条件下能促进水稻根、茎和叶的伸长生长，提高水稻的耐淹能力，具有双重作用，实属罕见。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将启动子possub5构建于pcambia1381载体质粒中的示意图，利用possub5启动子驱动下游gus基因表达。

图2为对本发明的pcambia1381-possub5启动子进行酶切验证的结果示意图，m:dnamarker2000。

图3为对获得的possub5：：gus转基因阳性水稻植株进行gus染色结果。

图4为在水淹条件下，荧光定量pcr方法检测possub5启动子驱动的gus基因表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。

实施例1、possub5启动子的获得及表达载体构建

根据常规方法提取水稻日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)基因组dna。根据genevestigator数据中的表达谱，我们筛选出一个受水淹诱导的基因loc_os10g40510，该基因表达了一个未知的proteaseinhibitor/seedstorage/ltpfamilyproteinprecursor。ncbi中提供的水稻品种全基因组序列，我们以loc_os10g40510转录起始位点上游1862bp作为其启动子，命名为possub5。利用primer5引物设计软件依据水稻possub5启动子的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，引物序列如下：

fp：gtcgactttcaagggaataaatcggtca

rp：gaattctgctgcaattgatcaagcaaaa

其中gtcgac碱基为限制性内切酶sali的识别位点及保护碱基；gaattc碱基为限制性内切酶ecori的识别位点及保护碱基。

采用天根试剂盒方法提取水稻基因组dna。以基因组dna为模板，利用正向引物、反向引物，采用phusion高保真dna聚合酶，按常规pcr体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

将pcr产物送去北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，并与ncbi中该启动子序列比对。测序结果表明，pcr产物具有序列表的序列，末端第1至1862位核苷酸所示的dna片段，并将序列表的序列末端第1至1862位核苷酸所示的dna片段命名为possub5。

用限制性内切酶sali和ecori酶切植物表达载pcambia1381，回收线性化载体骨架(约10657bp)。同时回收possub5片段。分别将线性化的载体骨架和possub5片段用progemat4连接酶连接，连接体系为：10×t4ligasebuffer1μl、t4ligase1μl、possub5片段2μl、pcambia1381质粒大片段6μl，4℃冰箱过夜连接16-18h，得到连接产物重组质粒，并将连接产物转化大肠杆菌。经过菌落pcr筛选重组子和双酶切验证正确的(检测结果如图2所示，所用marker为天根生化科技有限公司的markeriii)，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序并将测序。测序正确的重组子(如图1所b示)，提取其质粒，利用冻融法将其转化至农杆菌eha105中，挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。

实施例2、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50ml诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50ml无菌管中，加入实施例1中的农杆菌菌液(菌液od值在0.1～0.2范围内)浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

实施例3、possub5启动子的表达特性鉴定

按照天根试剂盒的方法，提取实施例2转化了启动子的转基因水稻叶片的dna，用潮霉素hpt基因检测引物进行扩增，挑出阳性转基因植株，结果如图3所示。

选取不带病斑、胚发育良好的pdro4：：gus转基因水稻种子去颖壳，70％乙醇浸泡并剧烈摇晃1min后，倒掉乙醇，加入50％的次氯酸钠(有效氯4％)和少许几滴tween20浸泡20min(150r/min，30℃)进行表面消毒。种子接种于含有25mg/l潮霉素的1/2ms培养基，于30℃、16h光照/8h黑暗条件下培养10天。在水淹胁迫处理时，将蒸馏时盖过转基因幼苗，并在正常生长条件下处理24小时，以未处理的转基因幼苗为对照。采用上述方法对处理前后的转基因幼苗进行gus染色(50ml0.5m磷酸缓冲液(ph7.0)，50μl100mm铁氰化钾k3fe(cn)6，50μl100mm亚铁氰化钾k4〔fe(cn)6〕·3h2o，1ml0.5medta，250μl1mg/mlx-gluc)。将各组织分别浸于gus染色液中，37℃过夜24小时。经75％乙醇脱色后，在体视镜下观察并记录gus染色的结果。结果如图3所示(标尺＝0.5cm)，在含有possub5：：gus转基因水稻植株中，水淹处理前只有根中有明显的蓝色(图3a)，而在茎和叶中没有着色(图3b和c)。这表明possub5启动子驱动gus基因只在根部表达，由此说明，possub5启动子是根部特异表达启动子。同时，在水淹胁迫处理后，在植株的根、茎和叶中都有明显的着色(图3d,e和f)，且根中的染色程度强于茎和叶，说明根中该启动子的水淹诱导活性强于茎、叶中该启动子的诱导活性，因此，possub5启动子是一个水淹诱导启动子，并且具有根特异性以及水淹特异性双重特性。

具体实施例4、荧光定量pcr鉴定possub5启动子水淹诱导活性

分别提取10天possub5：：gus转基因幼苗在水淹前后的rna。rna提取采用天根公司(北京)的植物rna提取试剂盒方法提取。荧光定量pcr(qrt-pcr)采用天根公司(北京)的superreal荧光定量预混液试剂盒(tiangen，sybrgreen，fp205)。以水稻actin基因作为内参基因对所用rna模板量进行定量。采用2^–δδct(δct＝ct目标基因-ct内参基因；δδct＝δct处理后-δct对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：

actin-fp，5’-cctgacggagcgtggttac-3’

actin-rp，5’-ccagggcgatgtaggaaagc-3’

用于内参基因actin的扩增；

gus-fp，5’-tacggcaaagtgtgggtcaataatca-3’

gus-rp，5’-caggtgttcggcgtggtgtagag-3’

用于gus基因的扩增。

定量rt-pcr结果如图4所示，以水淹处理前的10天大小的possub5启动子转基因植株整株中的gus基因表达量为1，当水淹处理12小时后，由possub5启动子驱动的gus基因表达量是处理前的25.3倍，这进一步说明，该启动子是一个水淹诱导启动子，它能够在水淹条件下，驱动gus基因的表达。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>一种水稻水淹诱导型组织特异性表达启动子possub5及其应用

<130>hci20170107

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1826

<212>dna

<213>水淹诱导型组织特异性启动子

<400>1:

tttcaagggaataaatcggtcataattttgtcttatttggtgcttcatatatatagtgaa60

tttgaagatgagactttacatataaatatgatactactgaaagcacatgtacaatttttt120

ttaaaaaaaattgatgaagttttgttagttgatatgcatgatgtatataaaagaaagctg180

gcttgtgtgcatatgatacgtttccaagtttcaaagtctgtaatttgaaacgactctaag240

tgatgagcacaatgcatgacacctttcgagaatgcagaaatgagggaaatacacacccat300

gcacagtcccacaccatgtctcacactcatattaatagataggcccaaactaacatcatg360

catgaataatcttataaaatattgaattgcattcaatatatgcaccctttggtggcttgg420

catgcaggtgaagtcatgtacaacaccacaaaccacacacacccaagaggtagttcccca480

cctaacgtacctagcttgttcagcatgcaagtggaatggtttgggccctcatatatatct540

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ttctcagtttatctctttgccgctgtgtgtgcgcatggtaggaaggttatgacgtgtttg1200

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gcttgcataggcgaaacccaccttgtgtaagatcgttggaagtaatatattcaggtgggt1320

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aacagaagttacggaccttagctagatgatctgaaaccataattgtacgagctctaattg1440

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gttcatccaatcaatcatccatactcacggtcgatcgattcttgattcgccgattgggta1620

ccacacgcatgatcatctaggcccccattcacgtactcatccatctacacatcttcttct1680

catcatctcctcctcctccatggccactataaataccactcgccatgcacactccaagca1740

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tagcttttgcttgatcaattgcagca1826

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>正向引物

<400>2:

gtcgactttcaagggaataaatcggtca28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>反向引物

<400>3:

gaattctgctgcaattgatcaagcaaaa28

<210>4

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<212>dna

<213>正向引物

<400>4:

cctgacggagcgtggttac19

<210>5

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<212>dna

<213>反向引物

<400>5:

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<210>6

<211>28

<212>dna

<213>正向引物

<400>6:

tacggcaaagtgtgggtcaataatca26

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>反向引物

<400>7:

caggtgttcggcgtggtgtagag23