与植物耐旱相关的NtDR1基因及其应用的制作方法

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个与植物耐旱相关的ntdr1基因及其应用的专利申请。

背景技术：

烟草是双子叶植物管花目茄科烟草属植物。烟草在生长期对水分要求较高，若遭受干旱胁迫会严重响应烟叶产量和品质。我国是一个水资源相对缺乏的国家，水资源时空分布不均，近年来我们部分烟区频繁遭受严重干旱，旱灾发生的频率和影响范围不断扩大，持续时间和遭受的损失增加，对我国烟叶生产产生了极大的影响。

通过兴修水利设施灌溉来解决烟草在生长季节时遭受的干旱问题，虽有不错的效果，但是成本太高，在短期内难于实现全部烟田有配套灌溉，而且在有些烟区受自然条件或其他因素影响，这种方式具有较大局限性。因此，获得及利用具有耐旱性的烟草新品种，对烟草的优质高产具有重要的生产应用意义。

传统的杂交育种方式中，受抗性亲本资源缺乏的限制，获得优良品种的进程十分缓慢。而随着烟草基因组计划的实施，烟草完成了全基因组测序。利用基因工程相关技术，从烟草中分离出耐旱相关基因并将其应用到耐旱烟草分子育种中，对于保证烟草的品质和产量具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一个与植物耐旱相关的ntdr1基因，该基因所表达蛋白能够增强植物耐旱性，从而为耐旱植物尤其是耐旱烟草新品种培育奠定基础。

一个与植物耐旱相关的ntdr1基因，包括1424bp碱基，其碱基序列如seqidno.1所示，其中特异性核酸序列为第1~921位核苷酸。

所述植物耐旱相关的ntdr1基因所编码蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述植物耐旱相关的ntdr1基因在增强植物耐旱性中的应用，超表达ntdr1基因后，植物耐旱性能得到提升。

用于超表达植物耐旱相关的ntdr1基因的重组超表达载体，将ntdr1基因与植物表达载体重组连接构建获得，所述植物表达载体可用于植物微弹轰击的载体，如pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin、pby505或其它衍生植物表达载体等。

所述用于超表达植物耐旱相关的ntdr1基因的重组超表达载体的构建方法，构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（camv）35s启动子、泛素（ubiquitin）基因启动子（pubi）、actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；

另外，构建过程中，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；

以具体的重组超表达载体（质粒）pcosac-ntdr1为例，将ntdr1基因插入pcosac的多克隆位点后，获得重组表达载体（质粒）pcosac-ntdr1；

所述pcosac是将pactin启动子（碱基序列如seqidno.3所示，长度为1424bp）插入pcambia1301的多克隆位点得到的重组质粒。

利用所述用于超表达植物耐旱相关的ntdr1基因的重组超表达载体pcosac-ntdr1所构建的ntdr1基因超表达植物新品种的培育方法，具体为：利用基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法，将重组超表达载体pcosac-ntdr1转化、并整合进入植物基因组中（例如烟草、拟南芥等），进一步通过筛选、鉴定获得ntdr1基因超表达植物新品种；所述ntdr1基因超表达植物新品种，其耐旱性能得到增强，具体表现为：植株在干旱条件下的萌发率得到提高，根长和根重等表型数据得到提升。

烟草ntdr1基因受是干旱诱导表达，在烟草耐旱过程中发挥重要作用。将构建好的过量表达载体转化模式植物拟南芥，获得过量表达ntdr1基因的拟南芥转基因植株。

本申请中，发明人通过克隆和分析ntdr1基因，认为该基因受干旱诱导表达，在烟草耐旱过程中发挥重要作用，与植物的耐旱性高度相关。进一步通过构建过表达质粒pcosac-ntdr1，并转化植物后，获得了过量表达ntdr1基因转基因植株。在模拟干旱或干旱条件下，与野生型对照相比，ntdr1过量表达转基因植株在萌发期可明显提高转化植物种子在干旱条件下萌发率，在幼苗期及营养生长期，转基因植株的根长和根重更有优势，表现出较好地耐旱性。基于这一结果，通过对ntdr1基因的深入开发利用，可为耐旱植物新品种开发和培育奠定一定理论和应用基础。

附图说明

图1为构建pcosac-ntdr1载体酶切图；其中1、2为酶切结果，m为marker；

图2为pcosac-ntdr1转基因拟南芥不同株系中ntdr1的表达情况；其中ck为对照，l1~l10为不同株系；

图3为pcosac-ntdr1转基因植株和对照在模拟干旱条件下的萌发率比较；

图4为pcosac-ntdr1转基因植株和对照在模拟干旱下的根长比较；

图5为pcosac-ntdr1转基因植株和对照的耐旱性表型。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。

生物材料：

烟草材料：栽培烟草（nicotianatabacum）k326，购自玉溪中烟种子有限责任公司；

拟南芥（nicotianabenthamiana），种子购买于abrc种子中心；

基因测序及引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；

过量表达烟草基因所用载体质粒pcambia1301购买于pcambialab；

pcosac载体是在pcambia1301基础上添加上水稻actin组成型表达启动，具体构建时，按现有技术参考如下流程构建即可：

（1）利用pcr技术从水稻培矮64s基因组中扩增得到pactin启动子（扩增序列如seqidno.3所示），pcr扩增时，引物序列设计如下：

上游引物：5’–ggtaccctcgaggtcattcatatgcttgag-3’，引物设计时增加了kpni切点，

下游引物：5’-ccatggcacgtgtctagatctacctacaaaaaagctccg-3’，下游引物设计时添加了xbai、pmaci和ncoi酶切位点；

（2）将上述扩增产物连接到pmd18-t载体上，转化，并进行酶切鉴定，确保重组正确；

（3）用kpni和ncoi对步骤（2）中带有正确目的片段的克隆进行酶切：先用ncoi酶切，接着用klenow将末端填平，然后再用kpni酶切；回收酶切产物，得到一端为kpni粘性末端，一端为平端的启动子片段；

（4）用kpni和pmaci对pcambia1301质粒（cambialabs）进行双酶切，同样得到一端为kpni粘性末端，一端为平端的载体片段；

（5）将步骤（3）与步骤（4）中酶切产物进行连接，转化、鉴定获得重组正确的pcosac载体；

实验试剂：

限制性内切酶、dntp、primerstargxldnapolymerase、dna凝胶回收试剂盒minibestagarosegeldnaextractionkit、质粒dna小量纯化试剂盒minibestplasmidpurificationkit、rna提取trizol试剂等，为invitrogen公司产品；

反转录试剂盒，roche公司产品；

dnaase酶，fermentas公司产品；

卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司。

实施例1

本实施例主要就ntdr1基因的获得过程简要介绍说明如下。

（1）、总rna提取

在正常生长条件下，对生长4周的栽培烟草k326取材，将样品材料在液氮中研磨成粉末状，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0mltrizol(invitrogen)的１.5ml离心管中，置-80℃保存备用；

采用trizol试剂提取法提取总rna，具体过程为：

将-80℃保存备用的样品取出，室温解冻后，加入200μl氯仿，振荡混匀；

离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μl异丙醇，沉淀、离心分离出rna；

再经75%酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的rnase-free的水，充分溶解；

所提rna经dna酶（fermentas）处理。

（2）、反转录为cdna

取2μg的k326总rna样品进行反转录，加入0.5μg/μl的oligo（dt）1μl，加入去离子水补足到12μl；

70℃保温5min后，依次加入5×rtbuffer4μl，20u/μl的rnase抑制剂1μl，10mmol/ldntp2μl，37℃保温5min；

然后加入200u/μlm-mlv反转录酶1μl，反应终体积为20μl；

42℃反应60min，70℃加热10min终止反应。

（3）、pcr体外扩增

pcr扩增参考了clontech公司的in-fisuon方法，人工合成一对引物，并在其5’端分别加上15-20bp载体互补序列；

上游引物及下游引物如下：

ntdr1-f：5’-gtaggtagatctagacacgttatcacagtctccgagttt-3’，

ntdr1-r：5’-attcacactccatggcactcagagtggctgtacattccgg-3’；

以上述步骤（2）所制备k326的cdna作为模板，以ntdr1-f和ntdr1-r为引物，采用高保真primestar®gxldnapolymerase（takara）进行pcr扩增；40μl反应体系设计如下：

gxldnapolymerase，0.8μl；

5×gxlbuffer，8μl；

dntp，4μl；

ntdr1-f，2μl；

ntdr1-r，2μl；

cdna，1μl；

ddh2o，22.2μl；

反应程序:98℃、10s；52℃、15s，68℃、1min，35个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，电泳检测pcr结果（结果如图1所示）。

电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒（takara）回收目的基因片断。

对所回收扩增产物进行测序，即为ntdr1基因，其包括1424bp碱基，其碱基序列如seqidno.1所示，其中特异性核酸序列为第1~921位核苷酸。

实施例2

利用实施例1所获得ntdr1基因，发明人进一步构建了转化用重组表达载体pcosac-ntdr1，相关过程简要介绍如下。

首先将实施例1所获得ntdr1基因与经pmaci酶切后的pcosac质粒进行连接，参照clontech公司的in-fusion无缝连接说明书，按试剂盒要求建立连接10μl的反应体系如下：

5xin-fusion，2μl；

pcosac（pmaci酶切后回收产物），4μl；

ntdr1，4μl；

50℃、15min，放冰上，用于下一步的转化。

采用热激法，将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，具体过程为：

无菌条件下取10μl连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；

42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min；

加无抗生素的lb培养基800μl，37℃摇床温和摇振1h左右；

取200μl培养液涂于含抗生素（kam）50μg/ml的lb固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。

挑取培养基中长出白色菌斑，分别接种于含有50μg/ml的kam的lb液体培养基中振荡培养12-16h，利用碱裂解法小量提取质粒dna（takara），所得质粒经bamhi和hindiii双酶切验证，结果正确的阳性克隆进一步送公司测序，以确保重组质粒构建正确。

实施例3

利用热激法，将实施例2所制备pcosac-ntdr1载体转化农杆菌gv3101（购于天根生化科技（北京）有限公司），抽提质粒并进行酶切鉴定，以确定表达载体pcosac-ntdr1成功转化农杆菌。

转化拟南芥：

采用农杆菌浸染花序法将表达载体整合到拟南芥（col-0）基因组中，筛选在含有潮霉素（50mg/l）的ms培养基上进行；

t2代种子继续在含潮霉素的ms上筛选，选取分离比例为3:1的株系在t3代继续筛选；

t3代时，若种子100%可以在含潮霉素的ms上生长，则认为该株系为纯合株系。

随机选取其中两个纯合株系进行分子检测。

采用trizol试剂提取法（invitrogen）提取拟南芥总rna，并反转录得到cdna；以此cdna为模板，进行实时定量pcr检测。如图2检测结果表明，ntdr1基因在不同转基因株系中均可表达，但表达水平存在一定差异。但也证明了ntdr1基因已整合到拟南芥基因组中，且在转基因拟南芥中能进行表达。

耐旱性鉴定

将上述转pcosac-ntdr1拟南芥移至温室培养，自交，收集转基因拟南芥的种子。同时以转pcosac空载体的拟南芥为对照。选取l1和l3两个表达水平相对较高的转基因株系用于后续的耐旱性鉴定。

将同期收获的转pcosac-ntdr1转基因拟南芥、转pcosac的拟南芥的种子消毒，种子分别点种到正常的ms培养基或含有200mm甘露醇的ms培养基上。培养皿放置于4℃，黑暗培养，2天后将皿取出放到光照培养箱中，常规生长条件培养（16h/8h，光期/暗期；22℃），4天后统计萌发率。

结果发现，ntdr1的转基因株系在模拟干旱条件下的萌发率明显高于对照（如图3所示）。

另外，将上述消毒、春化后的种子分别点种于含有200mm的甘露醇的ms培养基以及正常ms培养基上，生长条件如上述所示，保持培养皿直立，第14天测量根长。在模拟干旱的情况下，ntdr1转基因植株的根长生长受抑制情况比对照弱（如图4所示）。

将转pcosac-ntdr1转基因拟南芥、转pcosac的拟南芥萌发后转移到到营养土土中，常规条件生长3周后开始断水。断水14天后开始复水，复水一周后拍照。结果如图5所示，转pcosac-ntdr1拟南芥（l1、l3）在经历先断水后复水之后的成活率明显高于空载体对照。

综上所述：在干旱/模拟干旱胁迫下，转pcosac-ntdr1转基因拟南芥的耐受性明显强于与空载体对照。换言之，通过过表达ntdr1基因，可明显增强植株的耐旱性能。

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<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>与植物耐旱相关的ntdr1基因及其应用

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