耐旱植物的制作方法

专利名称：耐旱植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术和植物育种领域。所提供的是耐旱植物，尤其是耐旱蔬菜物种，如番茄(Solanum lycopersicum)，及用于产生遗传上修饰的耐旱植物或突变体耐旱植物的方法。本发明提供称为S1PP2C1的新基因，该基因编码he SIPP2C蛋白质，该蛋白质是脱落酸(absisic acid,ABA)反应的负调节物。S1PP2C1基因的下调、敲除或沉默导致植物具有显著提高的耐旱性。还提供在其基因组中包含突变体S1PP2C1等位基因且具有显著提高的耐旱性的植物、种子、果实和植物部分。在另一实施方案中，本文中提供用于产生在其基因组中包含一个或多个突变体S1PP2C1等位基因的耐旱植物的方法。
背景技术：
植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)对调节非生物胁迫反应(如干旱、盐度、 冷休克、创伤、病原体侵袭)及种子发育和休眠很重要。已多次使用针对具有改变的非生物胁迫反应或种子休眠的突变体的筛选，并导致了对ABA生物合成和ABA信号转导重要的基因的鉴定。通过这种筛选，已鉴定了拟南芥属(Arabidopsis)ABA不敏感突变体abil_l和 abi2-l(Koornneef 等 1984，Physiol Plantarum 61 :377-383)。AtABIl基因的克隆和表征揭示，它编码2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C， Leung等 1994,Science 264 :1448-1452 ；Meyer 等 1994,Science264 :1452-1455)。AtAB12 也编码2C型蛋白磷酸酶。abil-Ι和abi2-l突变体在AtABIl和AtABI2基因中携带突变，该突变在等同的位置上导致相同的Gly至Asp的取代(Leung等1997，Plant Cell 9 :759-771)。已显示两种突变体都具有降低的磷酸酶活性(Bertauche等1996，Eur J Biochem241 :193-200 ；Leung 等 1997，上文)，这暗示 AtABIl 和 AtAB12 是 ABA 敏感性的正调节物。但是，AtABIl的组成性过量表达抑制了 ABA在玉米原生质体中的作用，且已显示AtABIl和AtABI2的功能降低突变体对ABA具有高敏反应(hypersensitive response) (Scheen 1998， PNAS 95 :975-980 ;Gosti 等 1999， Plant Cell 11:1897-1909 ;Merlot 等 2001，Plant J25 =295-303)。总之，因此得出结论，AtABIl和AtABI2是ABA反应的负调节物。虽然abil-Ι和abi2-l中的突变诱导ABA不敏感性的确切机制仍未知，但它可能与突变蛋白质的优先核定位相关(Moes等2008，Plant J 54 :806-819)。AtABIl和AtABI2对种子休眠以及幼苗生长和气孔开张度(stomatal aperture)的调节很重要，暗示这些蛋白质在控制组织特异性ABA信号级联放大的主分支点之前发挥作用(Leung等1997，上文)。已在拟南芥属中鉴定了 76个PP2C，其中一个亚组(亚组PP2C-A，由9个基因组成)已与 ABA 信号转导相关(Schweighofer 等 2004，Trends in Plant Science 第 9 卷236-243)。还发现隶属于此组的几个拟南芥属基因编码ABA反应的负调节物。例如， AtP2C-HA (Rodriguez 等 1998，Plant Mol Biol 38 :879-883)(也称为 AtHABl，Saez 等 2004， Plant J 37:354-369)是调节诸如气孔关闭、种子萌发和营养生长抑制的许多ABA反应的 ABA信号传导途径的阻抑物。HAB2似乎也具有相似的调节作用。还已将AtPP2CA(Kuhn等 2006，Plant Physiol 140 :127-139)描述为ABA的负调节物，具有显示ABA高敏性的突变体。有趣地，基因破坏突变体显示ABA高敏性气孔关闭反应，而突变体的蒸腾作用(水分丧失)与野生型植物中并无不同。Yoshida等(2006,Plant Physiology 140 :115-126)还研究了 AtPP2CA中的错义功能丧失突变，其具有野生型的1/100蛋白磷酸酶活性，突变体拟南芥属植物由此在种子萌发期间显示ABA高敏性，但突变体植物与野生型相比未显示任何耐旱性变化(124页，LH Column，最后一段)。ABIl和ABI2是调节诸如气孔关闭、质膜的渗透透水性、干旱诱导的抗性和生根、 对葡萄糖的反应、高光胁迫、种子萌发和营养生长抑制的许多ABA反应的ABA信号传导途径的阻抑物。AHGl(At5g51760)是种子萌发期间的ABA负调节物(Nishimura等2007，Plant J 50 :935-949),而AHG3(At3gl 1410)是种子萌发和冷适应期间的ABA负调节物。另外三种(At5g9220、At2g^380和Atlg07430)终究未涉及ABA信号发放，因为无效突变未显示对 ABA 的敏感性的任何改变(Yoshida 等，2006 :Plant Physiology 140 :115-126) 因此，ABA生物合成和信号发放极其复杂，虽然已在拟南芥属中鉴定了似乎涉及其中的多种基因(PP2C-A组)，但它们在ABA依赖性反应，如非生物胁迫、种子休眠和幼苗生长中的作用在很大程度上仍不清楚。此外，蛋白质序列显示少许保守性，氨基酸序列具有少许序列同一性。基于蛋白质结构域(或基序)，如通常定位在蛋白质C端的催化结构域(蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶样结构域)，将基因按系统发生分组在一起。N端显著不同，且可以在底物结合中发挥作用或提供信号发放复合物的特异性附着位点。除体内功能不清楚夕卜，关于这些酶的亚细胞定位、底物和特异性或在体内如何调节这些单体酶也知之甚少。W02007/088234描述了 ABI1和HABl的组合失活增强了对ABA的反应，产生对盐度和水分胁迫(hydric stress)具有抗性的拟南芥属植物。图6和7中显示了 ABIl (SGN-U231558)和 HABl (SGN-U217609)的番茄直向同源物。还见 Saez 等 2006，Plant Physiol 141:1389-1399。虽然abil habl双突变体在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中导致耐旱性，但仍存在提供适合用于在作物植物中，尤其是在大田作物(例如稻、玉米、大豆、小麦、大麦、黑麦、高粱、芸苔属(Brassica)等)和蔬菜作物(例如番茄、黄瓜、洋葱、胡萝卜、卷心菜、花椰菜、椰菜、西瓜、甜瓜、莴苣、韭葱、菠菜、萝卜、马铃薯、朝鲜蓟、野莴苣、南瓜(pumpkin)、倭瓜 (squash)、豆、豌豆、辣椒等)中产生耐旱性的基因的需要。尤其是在蔬菜作物中，水分不足可以是大问题，因为许多作物的根浅，且许多产品通常新鲜出售，水分不足可以导致降低的蔬菜质量和降低的产率。果实和种子蔬菜，如番茄在开花期间及果实和种子发育期间对水分不足敏感。果实发育期间水分不足可以严重减少果实形成。应付潜在的水分胁迫环境的常见实践是灌溉作物和/或种植具有耐旱性的栽培种或变种，只要这些是可得的。还可以使用覆盖物和行遮盖物(row covers)。尽管有育种的努力，番茄植物仍对干旱敏感，且无市售耐旱栽培种可得。本发明提供适合用于产生耐旱作物植物，尤其是番茄植物和其他蔬菜植物的称为 S1PP2C1的新基因。本发明还提供产生耐旱植物的方法。还提供耐旱植物、它们自身的种子和植物部分(收获的果实等)。一般定义术语“核酸序列”(或核酸分子)指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“分离的核酸序列”指不再处于其所分离自的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞中或植物核基因组或质体基因组中的核酸序列。术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，而不涉及具体的作用方式、大小、三维结构或来源。因此，S1PP2C1蛋白质的“片段”或“部分”仍可以称为 “蛋白质”。用“分离的蛋白质”来指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。术语“基因”意指包含与适宜调节区(例如启动子)有效连接的在细胞中转录为 RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区)的DNA序列。因此，基因可以包含几个有效连接的序列，如启动子、含有例如涉及翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点的3’非翻译序列。“嵌合基因”(或重组基因)指正常情况下不天然见于物种中的任意基因，尤其是其中存在在自然界中不相互结合的一个或多个核酸序列的部分的基因。例如，启动子在自然界中不与部分或全部转录区或与另一调节区结合。术语“嵌合基因”理解为包含这样的表达构建体，其中启动子或转录调节序列与一个或多个编码序列或与反义序列(有义链的反向互补链)或反向重复序列(有义链和反义链，RNA转录物由此在转录时形成双链RNA) 有效连接。“顺式基因”是嵌合基因，其中优选全部基因序列，但至少转录序列来自在性别上与该基因所引入的物种相容的植物物种。“基因的表达”指其中与适当的调节区，尤其是启动子有效连接的DNA区域转录为 RNA的过程，该RNA具有生物活性，即能够翻译为具有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)，或者自身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)。编码序列可以处于有义取向，且编码希望的具有生物活性的蛋白质或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，其以反义取向或以正义和反义取向(反向重复)包含靶基因的短序列。“异位表达”指基因正常情况下不在其中表达的组织中的表达。“活性蛋白质”或“功能蛋白质”是具有可以例如通过体外活性测定在体外测量和 /或例如通过该蛋白质所赋予的表型在体内测量的蛋白质活性的蛋白质。“野生型”蛋白质是存在于野生型植物中的全功能蛋白质。本文中的“突变体蛋白质”是这样的蛋白质，在编码该蛋白质的核酸序列中包含一个或多个突变，该突变由此导致(突变体核酸分子编码) 例如可以通过体外(例如通过活性测定来与野生型蛋白质的活性比较)和/或体内(例如通过该突变体等位基因所赋予的表型)蛋白质活性来测量的“功能降低”或“功能丧失”的蛋白质。编码蛋白质的核酸分子中的“突变”是与野生型序列相比，例如通过一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入来改变一个或多个核苷酸。“点突变”是单个核苷酸的取代，或单个核苷酸的插入或缺失。“无义”突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，密码子由此变为终止密码子。这产生存在于mRNA中和截短蛋白质中的过早终止密码子(premature stop codon)。 截短蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。“错义”突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，密码子由此改变为编码不同的氨基酸。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。“剪接位点”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，前mRNA的RNA剪接由此改变，产生与野生型相比具有不同核苷酸序列的mRNA和具有不同氨基酸序列的蛋白质。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。“移码”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，mRNA的阅读框由此改变，产生不同的氨基酸序列。产生的蛋白质可以具有减少的功能或功能的丧失。调节序列中，例如基因的启动子中的突变是与野生型序列相比，例如通过一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入来改变一个或多个核苷酸，导致例如产生减少的基因的 mRNA转录物或不产生基因的mRNA转录物。“沉默”指下调或完全抑制靶基因或基因家族的基因表达。基因沉默方法中的“靶基因”是基因或基因家族(或基因的一个或多个具体等位基因)，其内源基因表达在嵌合沉默基因(或“嵌合RNAi基因”)表达和例如产生沉默RNA 转录物(例如能够沉默内源靶基因表达的dsRNA或发夹RNA)时下调或完全抑制(沉默)。 在诱变方法中，靶基因是待突变，以导致基因表达的改变(减少或丧失)或所编码的蛋白质的功能的改变(减少或丧失)的内源基因。一般通过将启动子与双链DNA分子有效连接来产生“有义” RNA转录物，其中该DNA 分子的有义链(编码链)为5’至3’取向，使得转录时转录出与有义DNA链具有相同的核苷酸序列(除RNA中通过U取代T外)的有义RNA。一般通过将启动子与有义DNA的互补链(反义链)有效连接，使得转录时转录出反义RNA来产生“反义” RNA转录物。“转录调节序列”在本文中定义为能够调节与该转录调节序列有效连接的(编码) 序列的转录速率的核酸序列。因此，本文中定义的转录调节序列将包含起始转录(启动子元件)、维持和调节转录所必需的所有序列元件，其包括例如弱化子或增强子。虽然大多数情况下指编码序列的上游(5’)转录调节序列，但此定义还涵盖见于编码序列下游(3’)的调节序列。本文中使用的术语“启动子”指核酸片段，其发挥作用来控制一个或多个基因的转录，就基因的转录起始位点的转录方向而言定位在上游，且通过依赖于DNA的RNA聚合酶的结合部位、转录起始位点和任意其他DNA序列的存在在结构上鉴定，该任意其他DNA序列包括但不限于转录因子结合部位、阻抑蛋白和激活蛋白结合部位，及本领域技术人员已知的直接或间接发挥作用来调节来自该启动子的转录量的任意其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在生理上(例如通过外部应用某些化合物)或发育上受调节的启动子。“组织特异性”启动子是仅在特定类型的组织或细胞中具有活性的启动子。本文中使用的术语“有效连接”指多核苷酸元件处于功能关系中的连接。在将它置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸“有效连接”。例如，如果启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则它与该编码序列有效连接。有效连接意指所连接的DNA序列通常相邻，且在必需连接两个蛋白质编码区时相邻且处于阅读框中，以产生“嵌合蛋白质”。“嵌合蛋白质”或“杂合蛋白质”是由多种蛋白质“结构域”(或基序)组成的蛋白质，在自然界中未发现该结构域这样连接，但其连接形成功能蛋白质，该功能蛋白质显示所连接的结构域的功能性。嵌合蛋白质还可以是存在于自然界中的两种或多种蛋白质的融合蛋白质。本文中使用的术语“结构域”意指具有特定结构或功能的蛋白质的任意一个或多个部分或一个或多个结构域，其可以转移至另一蛋白质，以提供至少具有该结构域的功能特征的新的杂合蛋白质。还可以用特定结构域来鉴定隶属于蛋白质S1PP2C1组的蛋白质成员，如来自其他植物物种的S1PP2C1直向同源物。见于S1PP2C1蛋白质中的结构域的实例是包含在SEQ ID NO: 2的约氨基酸84-391内的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C (PP2C或PP2C样) 催化结构域或S1PP2C蛋白质的N端区域(SEQ ID No 2的氨基酸1_83)。术语“引导肽(target peptide) ”指将蛋白质靶向至胞内细胞器，如质体，优选叶绿体、线粒体，或靶向至胞外间隙(分泌信号肽)的氨基酸序列。可以将编码引导肽的核酸序列融合(框内)至编码蛋白质氨基末端(N末端)的核酸序列。“核酸构建体”或“载体”在本文中理解为意指源自重组DNA技术的使用，并用于将外源DNA递送入宿主细胞的人工核酸分子。载体主链可以是例如本领域已知且描述于本文中其他地方的二元或超二元载体(见例如US5591616、US2002138879和W0950672》、共整合载体或T-DNA载体，其中整合入嵌合基因，或者如果其中已存在适宜的转录调节序列，则仅将希望的核酸序列(例如编码序列、反义序列或反相重复序列)整合在转录调节序列下游。载体通常包含其他遗传元件来便于它们在分子克隆中的使用，如例如选择标记、多克隆位点等(见下文)。“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指由于已将至少一个核酸分子引入该细胞中而产生的新的个体细胞的术语，该核酸分子尤其包含编码希望的蛋白质的嵌合基因或转录时产生用于沉默靶基因/基因家族的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)的核酸序列。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以作为染色体外(附加型) 复制分子包含核酸构建体，或者更优选地，包含整合入宿主细胞的核基因组或质体基因组中的嵌合基因。术语“选择标记”是本领域普通技术人员熟知的术语，在本文中用来描述任意遗传实体，其在表达时可以用来选择包含该选择标记的一个或多个细胞。选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性，或者更优选地，除草剂抗性或另一可选择的性状，如表型性状(例如色素形成的变化)或营养需要。术语“报道基因”主要用来指可见标记，如绿色荧光蛋白 (GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS 等。术语基因或蛋白质的“直向同源物”在本文中指见于另一物种中的同源基因或蛋白质，其具有与该基因或蛋白质相同的功能，但序列(通常)从具有该基因的物种趋异的时间点开始趋异(即通过物种形成进化自共同祖先的基因)。因此，可以基于序列比较(例如基于整个序列内和/或特定结构域内的百分比序列同一性)和/或功能分析二者，在其他植物物种中鉴定番茄S1PP2C1基因的直向同源物。术语“同源的”和“异源的”指核酸或氨基酸序列与它的宿主细胞或生物之间的关系，尤其是在转基因生物的背景中。因此，同源序列天然见于宿主物种中(例如用番茄基因转化的番茄植物)，而异源序列并非天然见于宿主细胞中(例如用来自马铃薯植物的序列转化的番茄植物)。取决于背景，术语“同系物”或“同源物”还可以指传承自共同祖先序列的序列(例如它们可以是直向同源物)。可以用“严格杂交条件”来鉴定与给定的核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境中将不同。一般而言，选择严格条件为比具体序列在确定的离子强度和PH下的热解链温度(thermal melting point, Tm)低约5°C。Tm是(在确定的离子强度和PH下)50%的靶序列杂交至完全配对的探针的温度。通常将选择这样的严格条件，其中PH 7下的盐浓度为约0.02摩尔，温度为至少60°C。降低盐浓度和/或增加
8温度可提高严格性。用于RNA-DNA杂交(使用例如IOOnt的探针的Northern印迹)的严格条件是例如包括在63°C下在0. 2XSSC中进行20分钟的至少一次洗涤的那些，或等同的条件。用于DNA-DNA杂交(使用例如IOOnt的探针的Southern印迹)的严格条件是例如包括在至少50°C、通常约55°C的温度下在0. 2 X SSC中进行20分钟的至少一次洗涤(通常为两次)的那些,或等同的条件。还见Sambrook等(1989) ；Sambrook和Russell (2001)。可以通过用总体或局部对比算法比对两个肽序列或两个核苷酸序列来测定“序列同一性”和“序列相似性”。然后可以在序列(在通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss 程序“Needle”(使用默认参数，见下文)最佳比对时)具有至少某最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)时将它们称为“基本上同一”或“基本上相似”。这些程序用 Needleman和^msch总体对比算法来在它们的全长内比对两个序列，最大化匹配数，而最小化缺口数。一般而言，使用默认参数，缺口产生罚分=10，缺口延伸罚分=0.5(对核苷酸和蛋白质比对二者而言)。对于核苷酸，所使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质， 默认评分矩阵是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89,915-919) 例如可以用计算机程序，如可从 Accelrys Inc.，9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752USA 或 EMBOSS(http://www. ebi. ac. uk/Tools/webservices/services/emboss)获得的 GCG Wisconsin Package, Version 10. 3来测定用于百分比序列同一性的序列比对和得分。备选地，可以通过针对诸如FASTA、BLAST等的数据库搜索来测定百分比相似性或同一性，但应返回命中序列并比对配对来比较序列同一性。在此文件中及其权利要求中，以它的非限制性含义用动词“包含”及其词形变化来指包括该词后的项目，但不排除未明确提到的项目。此外，除非上下文清楚地要求有且仅有元件中的一个，通过不定冠词“一”或“一个”提到元件不排除存在一个以上元件的可能性。 因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。还应理解，在本文中提到“序列”时， 一般提到具有某亚单位(例如氨基酸)序列的实际的物理分子。本文中使用的术语“植物”包括整株植物或其任意部分或衍生物，如植物器官(例如收获或不收获的贮藏器官、鳞茎、块茎、果实、叶等)、植物细胞、植物原生质体、可从其再生整株植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团块和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，如胚、花粉、胚珠、果实(例如收获的组织或器官，如收获的番茄等)、块茎(例如马铃薯)、花、叶、种子、块茎、鳞茎、通过克隆繁殖的植物、根、根状茎、茎、根尖等。 还包括任意发育阶段，如幼苗、未成熟和成熟等。“植物变种”是已知的最低等级的同一植物分类群内的一组植物，其(不考虑承认植物育种者的权利的条件是否得到满足)可以根据源自某种基因型或基因型组合的特征的表达来定义，可以通过那些特征中的至少一种的表达来与任意其他组的植物区分，且可以视为实体，因为它可以无任何改变地繁殖。因此，如果它们全都表征为存在1个基因座或基因(或由此单基因座或基因引起的一系列表型特征)，但就其他基因座或基因而言可以在其他方面彼此非常不同，则即使它们属于同一类型，也不可用术语“植物变种”来指该组植物。"FU F2等”指两种亲本植物或亲本品系间杂交后的连续相关世代。从两种植物或品系杂交产生的种子长出的植物称为Fl代。Fl植物自交产生F2代等。“F1杂种”植物 (或Fl种子)是从两个近交亲本品系杂交获得的世代。“Ml群体”是某个植物品系或栽培种的多个诱变种子/植物。“M1、M2、M3、M4等”指第一诱变种子/植物(Ml)自交后获得的连续世代。术语“一个或多个等位基因”意指具体基因座上的基因的一种或多种备选形式中的任一种，该等位基因全都涉及具体基因座上的一种性状或特征。在生物的二倍体细胞中， 给定基因的等位基因定位在染色体上的具体位置或基因座。同源染色体对的每条染色体上存在一个等位基因。二倍体植物物种可以在具体基因座上包含许多不同的等位基因。这些可以是基因的同一等位基因(纯合)或两个不同的等位基因(杂合)。术语“基因座”意指在染色体上发现例如基因或遗传标记的具体的一个或多个位置或部位。因此，S1PP2C1基因座是在基因组中发现S1PP2C1基因的位置。“野生型等位基因”(WT)在本文中指编码功能蛋白质(野生型蛋白质)的基因的形式。野生型S1PP2C1等位基因例如显示于SEQ ID N0:1中。“突变体等位基因”在本文中指与野生型等位基因相比在编码序列(mRNA或cDNA)或基因组序列中包含一个或多个突变的等位基因。这种(类)突变(例如一个或多个核苷酸的插入、倒位、缺失和/或取代) 可以导致所编码的蛋白质具有减少的体外和/或体内功能性(减少的功能)或无体外和/ 或体内功能性(功能丧失)，例如由于蛋白质例如截短或具有其中缺失、插入或取代了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。这类改变可以导致蛋白质具有不同的三维构象、靶向至不同的亚细胞区室、具有改变的催化结构域、具有改变的底物亲和力和/或特异性等。“耐旱性”或“显著增强的耐旱性”或“耐旱植物”在本文中指与适宜的对照植物 (例如野生型植物)相比，植物品系、栽培种或变种抵抗水分不足/水分胁迫/干旱的能力 (平均)显著增强，即与暴露于相同的水分胁迫条件的对照相比，耐旱植物中与水分胁迫相关的症状(例如叶萎蔫)(统计上)显著减少，和/或与对照植物，如野生型植物相比，暴露于水分不足/水分胁迫/干旱条件后植物的(平均)恢复率和/或存活率和/或可收获产率显著增加。如将在本文中其他地方解释，存在多种用于测定植物是否耐旱的方法。优选地，耐旱植物在所有发育阶段期间，但至少在以下发育阶段之一期间具有显著增强的耐旱性作为成熟植物，开花期间或开花期、果实形成和果实发育期间、种子发育期间、果实成熟期间。优选地，此外，植物还至少在种子阶段和/或幼苗阶段和/或从幼苗阶段至(且包括)成熟植物期间具有耐旱性。“野生型植物”在本文中指包含编码功能蛋白质的野生型(WT)S1PP2C1等位基因的植物(例如与包含突变体S1PP2C1等位基因的“突变体植物”相反)。这类植物是在表型测定中适宜的对照。优选地，野生型和/或突变体植物是“栽培植物”，即由人类栽培且具有良好农学特征的物种的变种、育种品系或栽培种；优选地，这类植物不是“野生植物”，即一般具有比栽培植物差的产率和比栽培植物差的农学特征，且例如天然生长在野生群体中的植物。“野生植物”包括例如物种的生态型、PI (植物引种)品系、当地品种或野生品种(wild accession)或野生亲缘品种，或者所谓的祖传变种(heirloom varieties)或栽培种，即在人类历史的较早时期普遍种植，但不用于现代农业中的变种或栽培种。“干旱”优选指短期水分不足或胁迫(人工的，例如无土壤灌溉，和/或自然的，例如无降雨)和/或长期水分不足或胁迫(人工的，例如无土壤灌溉，和/或自然的，例如无降雨)二者，短期水分不足或胁迫例如等于或少于30天、20天、15天、14天、10天、9、8、7、 6、5天或更少天数，长期水分不足或胁迫例如等于或多于31天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天或更多天数。S1PP2C1基因或蛋白质的“变体”包含见于物种番茄中的天然等位基因变体，以及见于其他植物物种，如其他双子叶植物物种或单子叶植物物种中的直向同源物二者。发明详述本发明人通过进行授粉的子房和GA3(赤霉酸)处理的子房的转录物组分析(cDNA-AFLP)来研究在番茄果实形成期间差异表达的基因(Vriezen等2008，New Phytologist 177 :60-76)。通过产生转基因植物进一步表征了与ABA(脱落酸)水平(未授粉的子房中高，授粉后低)相关的一个基因(其在未授粉的子房中相对高表达，在授粉的子房中表达较少)，以研究此基因在ABA信号发放中的作用。将该番茄基因命名为S1PP2C1 (番茄PP2C1)，因为它编码397个氨基酸的蛋白质，该蛋白质在约氨基酸84至391之间的C端区域中包含丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C催化结构域(如通过hterPrc^can测定)。发现S1PP2C1涉及ABA信号发放，且在CaMV 35S启动子的控制下过量表达此基因产生比野生型植物对植物激素ABA更不敏感的植物，而共抑制此基因(至少在叶组织中具有显著低于野生型植物的S1PP2C1转录物水平)的植物具有更高的ABA敏感性(见实施例)。因此，降低的(野生型)S1PP2C1蛋白质水平增强了 ABA敏感性，意味着S1PP2C1蛋白质是ABA信号发放的负调节物。令人惊奇地，还发现，与野生型植物相比，S1PP2C1转录物水平显著降低的番茄植物在9天的水剥夺后丝毫未显示萎蔫，而野生型植物具有萎蔫叶，且过量表达S1PP2C1的植物显示严重的萎蔫迹象。这甚至更令人惊奇，因为S1PP2C1基因和S1PP2C1蛋白质与已显示在拟南芥属的耐旱性中发挥作用的任意已知的ABA负调节物，如ABIl和HAB1，或与A组的蛋白质(见下文表1)中的任一种都不具有任何显著的序列同一性。表1-涉及ABA信号发放的拟南芥属蛋白质(假定的)(khweigerhofer等2004， 上文，见其中的

图1，A组)与S1PP2C1蛋白质之间的序列同一性
权利要求
1.非转基因植物，其基因组中包含S1PP2C1等位基因，S1PP2C1等位基因由此是编码包含与SEQ ID NO :2至少60%氨基酸序列同一性的蛋白质的等位基因，其特征在于所述 S1PP2C1等位基因在其核苷酸序列中包含一个或多个突变，且由此由于所述一个或多个突变，在其基因组中包含所述突变体等位基因的植物与在其基因组中包含野生型S1PP2C1等位基因的植物相比，具有显著增强的耐旱性。
2.权利要求1的植物，其特征在于所述一个或多个突变赋予所编码的S1PP2C1蛋白质功能丧失或功能降低。
3.权利要求1或2的植物，其中所述突变体S1PP2C1等位基因以纯合形式存在。
4.前述权利要求中任一项的植物，其中所述植物属于茄科、属于茄属、或属于番茄物种。
5.前述权利要求中任一项的植物，其中将植物暴露于相同的干旱胁迫时，与在其基因组中包含野生型S1PP2C1等位基因的植物的叶萎蔫症状相比，所述植物的叶萎蔫症状减少至少10%。
6.前述权利要求中任一项的植物，其中所述植物是杂种植物。
7.前述权利要求中任一项的植物的果实或种子或部分。
8.编码S1PP2C1蛋白质的核酸序列在产生具有增强的耐旱性的转基因植物或非转基因植物中的用途，其特征在于所述S1PP2C1蛋白质包含与SEQ ID NO 2至少60%氨基酸序列同一性。
9.转基因植物，其包含整合入其基因组中的嵌合基因，其中所述嵌合基因包含与核酸序列有效连接的在植物细胞中具有活性的启动子，所述核酸序列包含转录时沉默内源 S1PP2C1基因表达的S1PP2C1基因的有义和/或反义序列，且其中所述植物与缺乏所述嵌合基因的植物相比包含显著增强的耐旱性。
10.权利要求9的植物，其中所述内源S1PP2C1基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO 2至少60%氨基酸序列同一性。
11.权利要求8或9的植物，其中所述转录调节序列选自组成型启动子、诱导型启动子、 组织特异性启动子和发育调节启动子。
12.权利要求9-11中任一项的植物，其中所述植物选自以下属茄属、香瓜属 (Cucumis)、西瓜属(Citrullus)、莴苣属(Lactuca)、胡萝卜属(Daucus)、葱属(Allium)、辣椒属、玉蜀黍属、稻属、小麦属、大麦属(Hordeum)、芸苔属、大豆属、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、棉属、杨属、栎属、柳属。
13.权利要求9-12中任一项的植物的种子或果实或部分，其包含所述嵌合基因。
14.嵌合基因，其包含在植物细胞中具有活性的组织特异性、诱导型或发育调节启动子，所述启动子与核酸序列有效连接，所述核酸序列包含转录时沉默内源S1PP2C1基因的 S1PP2C1基因的有义和/或反义片段，其特征在于所述内源S1PP2C1基因包含与SEQ ID NO 1至少60%序列同一性。
15.非转基因耐旱番茄植物或其种子、后代或番茄果实，所述植物可通过TILLING获得，在其基因组中包含突变体S1PP2C1等位基因，其特征在于所述突变体等位基因编码与野生型S1PP2C1蛋白质相比具有功能降低或功能丧失的S1PP2C1蛋白质。
16.权利要求15的植物，其中所述S1PP2C1蛋白质在Glyl48、Serl71、Alal55或Glyl32上包含氨基酸取代。
全文摘要
本发明涉及具有新表型的转基因和非转基因植物领域。本发明所提供的是番茄丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(SlPP2C1)蛋白质和编码其的核酸序列，其用于赋予植物新表型，尤其是耐旱性。
文档编号C12N15/55GK102459615SQ201080034905
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月7日 优先权日2009年6月8日
发明者L·尼奇, W·H·弗里森 申请人:纽海姆有限公司