一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；(7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；(8)转基因纯合植株的抗逆分析。本发明玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3提高了转基因植物的耐旱及耐盐能力。
【专利说明】-种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物遗传育种领域，具体设及一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，该些地区水分供应不足，森林植被疏 稀，生态环境恶化，水±流失严重，自然灾害频繁。即使在±壤水分充足的情况下，水分亏缺 也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱、 高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所W又将干旱、高 盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个设及到多基 因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将该些基因及其表达产物分成两类，即 功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白 是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括；传递信 号和调控基因表达的转录因子等。
[0003] 植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，该些与抗逆境相关的 化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可W通过与顺式作用元件 结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫 的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因 转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，该样能促使多个功能基因发挥作 用，W期获得综合抗逆性状改良的植物。
[0004] 植物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列，又称E-box，发生特异性作用，调节启 动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目 前有关PIFs家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而其它物种的研究报道不多。
[0005] 本发明W玉米为研究材料，W拟南芥中的转录因子PIF3为查询序列，同源捜索玉 米核巧酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中的PIF3转录因子基因。
[0006] 目前，缺乏一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。 [000引本发明的技术方案如下；本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3,其由序列表 SEQ ID No. 5的核巧酸序列定义。
[0009] 本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIFS的编码蛋白，其特征在于：其由序列表 SEQ ID No. 6的氨基酸序列定义。
[0010] 本发明的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目 标植物，获得转基因植物。
[0011] 本发明所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：
[0012] (1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核巧酸序列及氨基酸序列；
[001引 （2)用RT-PCR获得玉米ZmPIFS基因片段；
[0014] (3)用巧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达 谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；
[0015] (4)利用电击法将步骤（3)得到的带有ZmPIFS的质粒转化农杆菌；
[0016] (5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；
[0017] (6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；
[001引 （7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；
[0019] 做转基因纯合植株的抗逆分析。
[0020] 进一步地，在步骤（3)中，将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经Bglll+EcoRI 双酶切后，利用DM回收试剂盒回收DM片段，将此片段与相应酶切的plOll载体相连，获 得的载体命名为pl〇ll-ZmPIF3。
[0021] 进一步地，在步骤（4)中，将构建好的双元载体pl011-ZmPIF3导入根癌农杆菌中， 农杆园园株为根癌农杆园EHA105两株。
[0022] 更进一步地，在步骤巧）中，所述的目标植物是水稻。
[0023] 本发明所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因 植物中的应用。
[0024] 进一步地，所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。
[0025] 有益效果：本发明的ZmPIF3基因为玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3,水稻转 化的功能分析表明提高了转基因水稻的耐旱及耐盐能力，可用于其他作物的抗逆转基因 应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。
[0026] 本发明通过对ZmPIF3基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：
[0027] (1)获得了对干旱及高盐胁迫有较高耐受性的转基因水稻。
[002引 （2)ZmPIF3基因具有抵抗干旱和高盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物 上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1是本发明ZmPIFS的核巧酸序列；
[0030] 图2是本发明ZmPIFS的氨基酸序列；
[0031] 图3是本发明ZmPIF3与拟南芥PIF3家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比 对；
[0032] 图4是本发明ZmPIF3与拟南芥PIFs转录因子氨基酸序列比对后所作进化树；
[0033] 图5是本发明ZmPIF3基因在阳G、化C1、ABA和低温条件下的诱导表达谱变化情 况；
[0034] 图6是本发明ZmPIF3转基因水稻T2代纯合株系内巧光定量检测。WT ;野生型； VC ;空载体；0E1-0E13 ;ZmPIF3转基因水稻；
[003引图7是本发明ZmPIFS转基因水稻在溶液中的耐旱性研究。WT ;野生型；VC谊载 体；0E3、0E5、0E11 ;ZmPIF3 转基因水稻；
[0036] 图8是本发明ZmPIFS转基因水稻在±壤中的耐旱性研究。WT ;野生型；VC谊载 体；0E3、0E5、OEll ;ZmPIF3 转基因水稻；
[0037] 图9是本发明ZmPIF3转基因水稻在溶液中的耐盐性研究。WT ;野生型；VC ;空载 体；0E3、0E5、0E11 ;ZmPIF3 转基因水稻；
[003引图10是本发明ZmPIF3转基因水稻在±壤中的耐盐性研究。WT ;野生型；VC ;空载 体；0E3、0E5、0E11 ;ZmPIF3 转基因水稻。
【具体实施方式】
[0039] 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，该些实施例仅用于说明 目的，而不用于限制本发明范围。
[0040] 如图1至图10所示，本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3,其由序列表SEQ ID No. 5的核巧酸序列定义。
[0041] 本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIFS的编码蛋白，其特征在于：其由序列表 SEQ ID No. 6的氨基酸序列定义。
[0042] 本发明的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目 标植物，获得转基因植物。
[0043] 本发明所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：
[0044] (1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核巧酸序列及氨基酸序列；
[0045] 本发明根据ZmPIF3基因的序列设计如下引物：
[0046] F ;5, -ATGTCCGACAGCAGCGACTTCG-3' 沈Q ID NO. 1，
[0047] R:5'-TCATGTTTCAGCCTCATTTCTTCC-3' 沈Q ID NO. 2。
[0048] 利用RT-PCR技术从玉米郑单958总cDNA中扩增得到ZmPIF3基因全长cDNA (开放 阅读框部分）。经测序表明为PIFs家族转录因子，ZmPIF3的全长cDNA为194化P，SEQ ID NO. 5,编码一个由645个氨基酸组成的蛋白，SEQ ID NO ;6。
[0049] 本发明根据ZmPIF3基因的cDNA序列设计如下检测引物；
[0050] F:5'-CAATCCAGCCACCATTCCC-3' SEQ ID NO. 3，
[005U R:5'-CTGTTGCTCCTGCACCATG-3' SEQ ID NO. 4。
[00巧 （2)用RT-PCR获得玉米ZmPIFS基因片段；
[0化3] (3)用巧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表 达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经 Bglll+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的plOll 载体相连，获得的载体命名为pl〇ll-ZmPIF3。
[0054] (4)利用电击法将步骤做得到的带有ZmPIFS的质粒转化农杆菌；将构建好的双 元载体pl〇ll-ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。通过农 杆菌介导法将ZmPIF3基因转化到水稻中，然后验证了转基因水稻对干旱、高盐胁迫的耐受 能力得到提高。
[0055] (5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；所述的目标植物是水稻。
[0056] 做目标植物转基因阳性苗的鉴定；
[0057] (7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；
[005引 做转基因纯合植株的抗逆分析。
[0化9] 本发明所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因 植物中的应用。
[0060] 所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。
[0061] 检测玉米经过阳G、化C1、ABA和冷处理后体内ZmPIF3基因的表达情况。结果表明 ZmPIF3受阳G、化C1、ABA和冷诱导表达。
[00创 实施例1
[0063] 玉米转录因子ZmPIF3核巧酸序列及氨基酸序列的获得
[0064] 登陆公共数据库NCBI主页，捜索到拟南芥中转录因子PIF3的氨基酸序列，W此氨 基酸序列为查询探针，获得了一个玉米中高度同源的PIF3转录因子基因ZmPIFS的核巧酸 序列和氨基酸序列如图1和图2所示。
[0065] 实施例2
[0066] 玉米转录因子ZmPIFS的分子克隆
[0067] 取=叶一巧期玉米幼苗，品种为郑单958,液氮速冻，放置-70°C冰箱中保存W备 提取总RNA。总RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取.玉米cDNA的合成 按 F'ermentas 公司的 Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作进行 第一链合成。
[0068] W上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，W设计的F : 5, -ATGTCCGACAGCAGCGACTTCG-3， SEQ ID NO.1 和 R:5, -TCATGTTTCAGCCTCATTTCTT CC-3' SEQ ID NO. 2为引物，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增条件为；94°C预热5min ; 94°C，40s, 57°C，40s, 72°C，2min,共 35 个循环；72°C，lOmin。PCR 结束后进行电泳分析， 采用百泰克公司的DM回收试剂盒回收约1900bp的扩增片段。将扩增片段连接到TaKaRa 公司的PMD19-T载体，转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR W鉴定阳性克隆，将阳 性克隆送到华大公司测序。
[0069] 根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与 PIFs家族转录因子同源关系最近，和拟南芥转录因子PIF3有较高同源性，因此我们将其归 入PIFs类转录因子，由于该基因是从玉米中克隆出来的，因此将其命名为ZmPIF3。ZmPIFS 与PIFs类转录因子保守的DM结合域比对及进化树分析如图3和图4所示。最终获得与 拟南芥转录因子PIF3具有较高同源性的玉米转录因子基因ZmPIF3。
[0070] 实施例3
[0071] 转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱分析
[0072] 将生长到四叶一巧期的水培玉米幼苗用于胁迫处理，干旱、高盐及ABA胁迫的幼 苗即分别置于含20% PEG、200mM化C1和100 uM ABA的溶液中，而低温胁迫的的玉米幼苗 则将其移入4°C环境中培养。不同胁迫下，分别于0, 1，6, 12, 24小时剪取幼苗叶片，每个时 间点至少取10株幼苗，每株幼苗取第四片充分展开的叶子的叶尖部分，约5厘米，迅速置于 液氮中速冻，并转移到-7〇°C冰箱保存，直至RNA抽提。RNA抽提和cDNA的合成如实施例2 所述。
[007引巧光定量PCR在ABI公司的7500定量PCR仪上进行，W设计的 F:5'-CAATCCAGCCACCATTCCC-3' 沈Q ID NO. 3和R:5'-CTGTTGCTCCTGCACCATG_3'沈Q ID NO. 4 为引物进行巧光定量 PCR,反应条件为；95°C Imin ;95°C，15s，60°C，20s，72°C，31s. 采集巧光信号，共40个循环；60°Cto 95°C,每rC采集一次巧光信号，持续Is。
[0074] 反应结束后，用ABI 7500自带的软件进行分析及绘图。ABA及低温处理的表达谱 如图5所示，经过干旱处理6小时后，ZmPIF3基因的表达量开始增加，处理12小时后该基 因强烈表达，表达量约为未处理时的13. 7倍，经过高盐处理1小时后，ZmPIF3基因的表达 量开始增加，处理12小时后该基因强烈表达，表达量约为未处理时的11. 2倍。
[0075] 实施例4
[0076] 转录因子基因ZmPIF3植物表达载体的构建
[0077] 将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经Bglll+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试 剂盒回收194化p，SEQ ID NO. 1，左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的plOll载体相连， 获得的载体命名为pl〇ll-ZmPIF3。
[007引实施例5
[0079] 农杆菌培养和植物转化
[0080] 农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。质粒pl011-ZmPIF3经电击法导入农杆 菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基，50mg/l利福平，培养过夜，取5ml菌液转接到100ml Y邸培养基，50mg/l利福平，培养至0D600 = 0. 7-0. 8,菌液冰上放置lOmin，5000巧m离屯、 10min，4°C，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10%甘油悬浮菌体，转到 50ml离屯、管。5500巧m离屯、10min，4°C。收集菌体，加入500 10%甘油悬浮菌体，转到 1.5ml离屯、管。取70yl感受态细胞，加入lyl重组质粒pl011-ZmPIF3。用去头的枪头混 匀，转到0.1畑1电击杯中。电击参数；200〇，1.71(￥，2.5。，电击后立即加入800 ^180(：培养 液。培养1小时后，取100 y 1涂抗性板筛选转化子，28°C培养。
[0081] 植物转化采用农杆菌介导法取在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/L卡那 霉素Kanamycin，Km的LB固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/L Km的LB 液体培养基中，于28°C振摇培养过夜；再按1/lOOv/v接种量接种于AB液体培养基中。当 培养至对数生长期时，离屯、收集农杆菌并重悬于l〇-15ml AAM，含100-400]imol/l己酷了 香酬液体培养基中，立即用于水稻受体材料的共培养。将已培养好的未成熟胚或成熟胚来 源的初生愈伤组织浸泡于此农杆菌菌液中。侵染20min后将愈伤组织放在无菌滤纸上吸干 过多的菌液，然后将愈伤组织转入NeDsC培养基上于28°C黑暗条件下共培养3天。将经农 杆菌浸染后的愈伤组织转入含25mg^潮霉素和600mg^头抱霉素的选择培养基CCD2S1培 养基上进行第一轮筛选培养；两周后将长出的新鲜抗性愈伤组织再转入含50mg/l潮霉素 和300mg^头抱霉素的选择培养基CCD2S2上继续筛选2代，2周/代。愈伤组织经过连续3 代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到预分化培养基MSPR上进行预分化。2 周后再将预分化的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上，于12虹光照/天、28°C条件下 进行分化。再生的小苗在1/2MS。培养基上生根壮苗，最后移到田间或温室栽培。转基因水 稻按常规方法进行栽培管理。
[0082] 利用50mg/mL潮霉素对转化植株叶片进行初筛，再通过PCR进一步鉴定，获得T。代 转基因植株，用同样的方法筛选获得Ti代转基因阳性植株及T 2代转基因纯合材料。
[0083] 农杆菌转化过程所用各培养基组份如下：
[0084]
【权利要求】
1. 一种玉米转录因子基因ZmPIF3,其特征在于：其由序列表SEQIDNo. 5的核苷酸序 列定义。
2. -种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo. 6 的氨基酸序列定义。
3. -种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得 转基因植物。
4. 根据权利要求3所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于包括下述步 骤： (1) 获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列； (2) 用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段； (3) 用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将 ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中； (4) 利用电击法将步骤（3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌； (5) 将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物； (6) 目标植物转基因阳性苗的鉴定； (7) 目标植物转基因'代阳性纯合植株的筛选； (8) 转基因纯合植株的抗逆分析。
5. 根据权利要求4所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤（3) 中，将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经Bglll+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒 回收DNA片段，将此片段与相应酶切的plOll载体相连，获得的载体命名为pl011-ZmPIF3。
6. 根据权利要求1所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤 (4)中，将构建好的双元载体pl011_ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌 EHA105 菌株。
7. 根据权利要求4所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤（5) 中，所述的目标植物是水稻。
8. 根据权利要求1或2所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐 盐的转基因植物中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。
【文档编号】C07K14/415GK104513823SQ201410680035
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】高勇, 陈建民, 江薇, 戴毅, 陆怡, 吴美琴, 任晓芸 申请人:扬州大学