专利名称：植物耐旱相关蛋白GpLhcb5及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物耐旱相关蛋白GpLhd35及其编码基因与应用。
背景技术：
苔藓植物是自然界的拓荒者之一，许多种属具有很强的耐旱能力，在世界范围内 的干旱、半干旱地区广泛分布着耐旱藓类，起着重要的生态作用。苔藓是水生到陆地的先 锋植物，面临干旱与低温等恶劣环紧的胁迫，苔藓植物形成了一套独特的适应恶劣环境的 机制，成为极端生境的主要植被和极地海拔地带的优势植被类群。藓类植物的抗旱能力极 强，其极端的耐旱能力早就引起研究者的密切关注，其研究水平已经深入到寻找抗旱基因 水平。当植物处于高于光合作用所能利用的光强时易产生光抑制，甚至光破坏。植物的 避光性反应就是前一种降低能量捕获机制的反映。而过多能量的非辐射耗散则是通过LHC 蛋白参与不同过程的复杂机制来实现的。这种机制是通过PSII的捕光色素结合蛋白在跨 类囊体膜的Δ pH存在下和从PSII反应中心转移能量的调节来使能量陷井开放。此过程产 生光保护以保证在高光强下不降低光合效率。研究表明若LHCII的含量减少，则会干扰植 物执行正常光合功能时所必需的类囊体膜的正常垛叠，使类囊膜的结构发生紊乱，那么就 无法维持类囊体的功能，随之会产生叶绿素的丧失，进而导致光合系统的崩溃，植株的生活 力会立即下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐旱相关蛋白GpLh(A5及其编码基因与应用。本发明提供的植物耐旱相关蛋白(GpLhcb5)，来源于毛尖紫萼藓(Grimmia. pilifera)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐旱性相关的由序列2衍生的蛋白质。序列表中的序列2由310个氨基酸残基组成，包含一个叶绿素a/b结合的超家族 (Chloroa_b-bind Superfamily)(自序列 2 的 106 至 274 位氨基酸残基)。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指将序列2的上述 结构域外的氨基酸进行取代/或缺失和/或添加。序列表中的序列1所示的由1176个核苷酸组成，自5’第1至74位核苷酸为5’ 非编码区(5，-UTR) (74bp)，第75至1007位核苷酸为编码序列(933bp)，第1008至1010位 核苷酸为终止密码子，第1011至1176位核苷酸为3，非编码区(3，-UTR) (169bp)。 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包含双元农杆菌载体和可用与植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆 贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 (ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以ATG起始密码子或邻近接区起始密码子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个 序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，也可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体1利用(iateWay技术，先将所述基因PCR产物前加CACC四个碱 基，将含有CACC的PCR产物与pENTR/D-TOPO进行Capture反应，之后用pENTR-target与 目的载体pEarley Gate201进行Recombine反应得到最终载体；所述重组表达载体2利用 Gateffay技术，先将所述基因PCR产物前加CACC四个碱基，将pMDC32载体的35S启动子用 BamHI和PstI切除并连上AtLhcb5promoter，后用pENTR-target与目的载体pMDC32进行 Recombine反应得到最终载体。含有以上任一所述基因(GpLhcb5)转基因细胞系、重组菌均属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育耐旱转基因植物的方法。本发明所提供的培育耐旱转基因植物的方法，可将编码所述植物耐旱相关蛋白的 基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐旱能力高于目的植物的转基因植物。具 体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到耐旱能力高于目的植物的转基因 植物。本发明同时提供了一种培育持水力提高的转基因植物的方法，是将所述植物耐旱 相关蛋白的基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到持水力高于目的植物的转基 因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到持水力高于目的植物的 转基因植物。作物离体叶片在空气中的相对含水量反应叶片的持水力，或称植物组织的抗 脱水能力。离体叶片失水速率与植株的抗旱之间有密切关系。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获得耐旱能力增强的转基因细胞系及转基因植物。携带有所述基因的表达 载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植 物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、水稻、小麦等。
本发明发现了一种植物耐旱相关蛋白(GpLhcb5)及其编码基因(GpLhcb5)。 GpLhcb5基因可在干旱胁迫下诱导表达。将转化GpLh(A5基因后得到的过量表达的拟南芥 植株进行逆境生理实验，证明转入GpLh(A5基因后，可以提高拟南芥的耐旱性。将GpLhcb5 基因转化到拟南芥AtLh(A5功能缺失型突变体进行回补实验，证明转入GpLh(A5基因后拟 南芥AtLh(A5功能缺失型突变体的耐旱性有所提高。本发明的耐旱相关蛋白及其编码基因 为人为控制植物中耐旱相关基因的表达提供了基础，将在培育耐旱植物中发挥重要作用。以下结合附图及具体实施进一步阐述本发明。
图1. A.毛尖紫萼藓GpLhcb5蛋白的序列分析。毛尖紫萼藓GpLhcb5与小立碗藓 (ΧΡ_001786046. 1)的相似性为92%，与松树(CAA78900. 1)的相似性分别为80%，与拟南 芥(ΝΡ_192772· 1)的相似性为76%，与芸苔属植物(CAA65042. 1)的相似性为75%。实线 指示叶绿素a/b结合super-family。毛尖紫萼藓GpLh(A5蛋白与其他Lh(A5蛋白相应结构 域的序列比对。本图显示为毛尖紫萼藓，拟南芥，水稻，芸苔属植物等蛋白的保守氨基酸。B.毛尖 紫萼藓 GpLhcb5, Arabidopsis thaliana、Brassica juncea、 Populustrichocarpa> Nicotiana tabacum> Capsicum annuum> Phyllostachys edulis、 Pinussylvestris> Grimmia pilifera P. Beauv> Physcomitrella patens tBlSi Lhcb5 StJ 化分析。图2.毛尖紫萼藓GpLh(A5基因的表达受干旱胁迫诱导。提取不同干旱胁迫时间 点毛尖紫萼藓的总RNA用于RT-PCR，扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，Actin作为 内参对照。图3.过表达载体pEG201-GpLh(A5构建示意4.转基因拟南芥提取基因组DNA进行PCR鉴定图 5. Real-time RT-PCR 方法检测!35S: :GpLhcb5 转基因拟南芥mRNA 水平 GpLhcb5
基因的表达量图6. 35S: :GpLhcb5转基因植物的干旱耐受性被提高图7.拟南芥野生型及转基因植物失水率的测定图8. AtLhcb5mutant染色体T-DNA插入位点示意9. LB、RP和LP、RP两组引物进行PCR检测AtLhcb5mutant纯和体图10. AtLhcb5mutant和野生型的形态学观察图11. AtLhcb5mutant和野生型植株正常生长的株高进行测量图12. pMDC32-GpLhcb5功能缺失型突变体回补表达载体构建示意图
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限于本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂公司购买得到。毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera P. Beauv.)采自山东省青岛市崂山。实施例1、 毛尖紫萼藓光系统II捕光色素复合体蛋白基因及蛋白质序列的发现
在高通量筛选获得毛尖紫萼藓干旱胁迫下相关候选基因信息的基础上，针对特 异表达的抗旱相关的光系统II捕光色素复合体蛋白基因(GpLhcl^)，挑选一段368bp的 GpLhcb5的EST，设计特异扩增引物，通过5’及3’ -RACE的方法获得全长序列。将得到的 5’端和3’端序列拼接获得ORF序列，并重新设计引物扩增得到全长片段，测序最终得到全 基因序列。下图为3’ RACE,5' RACE引物设计
权利要求
1.一种编码植物耐旱相关蛋白的核酸分子，其特征在于所述基因是如下1)或2)或 3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列1自5’第75至1007位核苷酸所示；2)序列表中序列1所示；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐旱相关蛋白。
2.一种植物耐旱相关蛋白的多肽，其特征在于所述多肽是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐旱性相关。
3.含有权利要求1所述核酸的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求1 所述核酸经过Gateway拓扑置换方法转入pEarleyGate201/pMDC32载体得到的。
5.含有权利要求1所述核酸的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述核酸的重组菌。
7.一种培育耐旱转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求1所述核酸导入目的植 物中，得到耐旱能力高于目的的植物的转基因植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求1所述核酸通过权利要求3或4所 述重组表达载体导入目的植物中。
9.如权利要求7或8所述的方法，所述目的植物为拟南芥。
10.一种培育持水力提高的转基因植物的方法，是将权利要求1所述核酸导入目的植 物中，得到持水力高于目的植物的转基因植物。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于权利要求1所述核酸通过权利要求3或4 所述重组表达载体导入目的植物中。
12.如权利要求10或11所述的方法，所述目的植物为拟南芥。
13.权利要求1所述核酸或权利要求2所述多肽在提高植物抗旱能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护编码所述蛋白的基因。所述蛋白及其编码基因为控制植物中耐旱相关基因的表达提供了基础，应用转基因技术有效地利用该基因，可提高植物在缺水环境下的适应性，最终达到提高植物抗旱能力的目的。
文档编号C12N15/29GK102115753SQ20101057596
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者李萌萌, 王英典, 赵君怡 申请人:北京师范大学