专利名称：激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的基因，具体是一种植物病原黄单胞菌中激发植物 产生过敏反应的蛋白质HlpB基因。
背景技术：
植物对病原物侵染的抗性表现在非寄主和寄主抗性两个方面。革兰氏阴性植物病 原细菌在非寄主植物上产生过敏反应(Hypersensitive response, HR)是由病原菌中的某 些激发子决定的。这种HR是一种抗病免疫反应，相应激发产生HR的蛋白质称为harpin类 蛋白。目前已从革兰氏阴性植物病原细菌中鉴定的harpin蛋白种类有HrpZ，HrpN, Hrpff, PopAl，Hpal，HopAKl和HopPl，并且明确植物病原黄单胞菌中仅存在HrpW和Hpal这两个激 发非寄主植物产生HR的harpin类蛋白。这些harpin蛋白具有共同的特点具亲水性、富 含甘氨酸、对热稳定、对蛋白酶敏感、酸性蛋白。Harpin类蛋白具有重要的生物学功能。harpin类蛋白在植物上产生的HR是一种 细胞编程死亡形式，在这个过程中伴随着活性氧进发、水杨酸积累、病程相关蛋白产生和胼 胝质增加等，从而增加植物的抗病免疫性。Harpin类蛋白施用于植物上，可促进植物生长、 增加作物产量和诱导植物产生抗病性等。植物病原黄单胞菌harpin类蛋白及其编码基因 具有植物抗病育种价值和生防价值，而且具有分离和鉴别植物抗病免疫基因的功能，发掘 可使植物产生抗病免疫反应的植物病原黄单胞菌中的harpin类蛋白及其编码基因具有重 要的科学价值和实践价值。经对现有技术的文献检索发现，未发现植物病原黄单胞菌中可激发植物产生抗病 免疫反应的HlpB蛋白以及相应编码基因hlpB的有关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种激发植物产生过敏反应的蛋 白质HlpB基因。本发明HlpB蛋白能够在病原黄单胞菌的非寄主植物上激发过敏反应。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及的激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因，其序列为SEQ ID NO. 1， 序列长度为552bp ；所述的HlpB基因编码182个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO. 2 ； 所述的氨基酸序列中不含半胱氨酸，蛋白质等电点为5. 28，呈酸性，富含甘氨酸，分子量 19. 5kD，甘氨酸含量达20%。所述的HlpB基因产物HlpB可在烟草上产生过敏反应。过敏 反应是植物抗病性被激活的结果。本发明的hlpB基因是由以下方法构建而成利用引物hlpB-F(SEQ ID NO. 3) :5，-TAGAATTCATGGCCCGCGG-3，和 hlpB_R(SEQ ID NO. 4) :5，-ATTGTCGACTCAGAACGGGATATCGT-3，通过 PCR 扩增，可从水稻条斑病菌 RS105 菌 株、水稻白叶枯病菌PX099A菌株、甘蓝黑腐病菌kv 85-10菌株、柑橘溃疡病菌fee 306菌 株以及辣椒斑点病菌)(cc8004菌株基因组DNA中扩增得到hlpB基因。通过EcoRI和Ml I限制性酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体pET41a(+)上，转化到表达宿主菌BL21(DE3)中， 并筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，该转化子为HlpB表达工程菌株。该工程菌株经过 诱导表达，超声破碎，高速离心的方法得到可溶性HlpB粗提蛋白。粗提蛋白经过GSTtrap 柱纯化和肠激酶酶切GST标签后得到完整的HlpB纯蛋白。HlpB纯蛋白注射三生烟，发现能 够在烟草上激发过敏反应。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明获得的激发子蛋白HlpB具有harp in蛋白的特性，能激发烟草产生HR反应 和系统获得抗病性，这为设计诱导植物产生系统获得抗病性的基因工程药剂以及转基因植 物提供了重要的基因资源，具有重要的实践价值。本发明中所涉及的水稻条斑病菌株RS105和水稻白叶枯病菌PX099a菌株已在 文 献((Wu Xiaomin, Li Yurong, Zou Lifang, and Chen Gongyou. 2007. Gene-for-gene relationships between rice and diverse avrBs3/pthA avirulence genes in Xanthomonas oryzae pv.oryzae. Plant Pathology, 56 (1) :26-；34》中公开；涉及的柑 ffi Μ ^ ^ 306 ^ ^ B ^ ； K ((da Silva, A. C. R. ， Ferro, J. A. ， Reinach, F. C. ， et al.2002. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities. Nature 417(6887) :459_463》中公开；设计的柑橘甘蓝黑腐病 M 85-10 ^ ^ B ^ ^； K《Thieme， F. ， Koebnik, R. ， Bekel, Τ. ， et al. 2005. Insights into Genome Plasticity and Pathogenicity of the Plant Pathogenic Bacterium Xanthomonas campestris pv.vesicatoria Revealed by the Complete Genome Sequence. J. Bacteriol. 187(21) :72讨_7洸6》中公开；涉及的辣椒斑点病菌8004菌株已在《Qian，W.， Jia, Y. -T. , Ren,S. -X. ,et al. 2005. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv. campestris. Genome Res. 15(6) :757-767))中公开。
图1、HlpB蛋白表达和纯化电泳2、HlpB在烟草上激发过敏反应的最低浓度测试图3、不同植物病原黄单胞菌来源的HlpB蛋白在烟草上激发过敏反应图
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、植物病原黄单胞菌hlpB基因原核表达载体构建本实施例从水稻条斑病菌RS105菌株、水稻白叶枯病菌PX099a菌株、甘蓝黑腐病 菌85-10菌株、柑橘溃疡病菌306菌株以及辣椒斑点病菌8004菌株基因组DNA中hlpB基 因为模版，设计引物 hlpB-F(SEQ ID NO. 3)和 hlpB_R(SEQ ID NO. 4)，进行 PCR扩增，PCR扩增条件为94°C /4min+(94°C /30sec+55°C /30sec+72°C /30sec) X35 循环 +72°C /IOmin0 最终PCR产物连接在pMD18-T载体，连接产物转化感受态细胞DH5 α，筛选具有Amp抗性的 重组转化子pThlpB。重组转化子经EcoR I和Ml I双酶切回收hlpB片段，连接入经过相 同酶切处理的表达载体pET41a(+)，连接产物转化DH5 α，获得正确的重组质粒pHilpB，将 pEhlpB转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌株BL2IpEhlpB。水稻条斑病菌RS105菌株、水稻白叶枯病菌PX099a菌株、甘蓝黑腐病菌85_10 菌株、柑橘溃疡病菌306菌株以及辣椒斑点病菌8004菌株为公知公用菌株。pMDIS-T和 pET41a(+)载体为公知公用菌株，载体特征见文献=TAKARA公司产品说明书和Nerk公司产 品说明书。大肠杆菌 BL21(DE3)菌株见文献 Sambrook J.，Fritsch EF.，and Maniatis Τ. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.本发明所用内切酶为EcoR I和Ml I。2、HlpB蛋白的原核表达和纯化本实施例表达菌株BL21pEHlpB从单克隆出发，37°C过夜培养的种子液按转 接至新鲜的LB+Km培养基中，扩大培养池后菌体生长进入对数生长期，加入终浓度ImM的 IPTG，37°C下继续诱导培养4h后，收集菌体。用PBS缓冲液悬浮菌体，经过超声波细胞破 碎后，离心去除菌残体，上清为含有GST-HlpB的粗提蛋白(图1总蛋白)。粗提蛋白经过 GSTrap蛋白纯化柱纯化后，得到纯化后的蛋白(图1纯化蛋白)，再用肠激酶22°C处理1 切除GST蛋白标签，将得到的HlpB与GST混合蛋白液通过GSTrap蛋白纯化柱除去GST，流 出相为HlpB纯蛋白(图1去标签蛋白)。并用BCA Kit蛋白定量试剂盒测定HlpB纯蛋白 浓度。蛋白的原核表达为常规的分子遗传操作，GSTrap蛋白纯化柱为GE Health公司产品， BCA Kit为碧云天公司生产的蛋白精确定量试剂盒。本实施例三生烟为HR测定最常用的烟 草品禾中 Nicotiana tabacum cv Xanthi,公知公用。3、HlpB激发烟草过敏反应的测定本实施例HlpB经BCA kit测定蛋白浓度后，调整终浓度lmg/ml，并用PBS buffer 进行梯度稀释为9种不同的浓度，接种三生烟确定最小HR激发浓度，同时用相同浓度的 Hpal注射烟草作为阳性对照，24h后观察烟草叶片过敏反应。经测定发现HlpB激发HR的 最小浓度为0. lmg/ml (图2)。4、植物病原黄单胞菌的HlpB蛋白激发烟草过敏反应的测定本实施例从水稻白叶枯病菌PX099a菌株、甘蓝黑腐病菌85-10菌株、柑橘溃疡病 菌306菌株以及辣椒斑点病菌8004菌株等黄单胞菌以及非黄单胞菌属的梨火疫病菌中克 隆出hlpB基因，构建在pET41a(+)载体上，提取蛋白液，调整终浓度lmg/ml，注射接种三生 烟，用相同浓度的HlpBx。。蛋白为阳性对照，24h后观察烟草叶片过敏反应。发现来自水稻白 叶枯病菌PX099A菌株、甘蓝黑腐病菌85-10菌株、柑橘溃疡病菌306菌株以及辣椒斑点病菌 8004菌株的HlpB蛋白均能够激发烟草产生过敏反应，但是梨火疫病菌的HlpB不能够在烟 草上激发过敏反应(图3)。关于RS105 陈功友、潘小玫、王金生，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ρ v. oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报，2001，31 (3) 199 207 ；关于基因重组分子操作Sambrook J, Russell D. W. , Molelcular cloning, ALaboratory Manual(3rded),2001, Spring Harbor Laboratory Press ；关于克隆harpin 相关基因的方法:ffen W. G, Wang J. S, Defense response in plants induced by Harpinxoo, an elicitor of Hypersensitive response from Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 2003, Journal of Agricultural Biotechnology ；关于克隆载体pMD18_T和表达载体pET41a(+) :TAKARA载体说明书和Nerk基因表 达载体说明；关于蛋白原核表达和纯化Nerk基因大肠杆菌表达系统说明书。
权利要求
1.一种激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因，其特征在于，其序列为SEQ ID NO. 1，序列长度为552bp。
2.根据权利要求1所述的激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因，其特征是，所述 的HlpB基因编码182个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
3.根据权利要求1所述的激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因，其特征是， 所述的氨基酸序列中不含半胱氨酸，蛋白质等电点为5. 28，里酸性，富含甘氨酸，分子量 19. 5kD，甘氨酸含量达20%。
4.根据权利要求1所述的激发植物产生过敏反应的蛋白质HlpB基因，其特征是，所述 的HlpB基因产物HlpB在烟草上产生过敏反应，过敏反应是植物抗病性被激活的结果。
全文摘要
一种生物技术领域的来自植物病原黄单胞菌中的可激发植物产生过敏反应的基因HlpB，该基因序列为SEQ ID NO.1，序列长度为552bp；HlpB基因编码182个氨基酸，氨基酸的序列为SEQ ID NO.2；HlpB蛋白不含半胱氨酸，等电点为5.28，富含甘氨酸，分子量为19.5kDa，对热不稳定，对蛋白酶敏感，能在烟草上激发过敏反应产生。本发明获得的HlpB基因可作为植物抗病育种的基因资源，HlpB蛋白可作为蛋白质药物激发植物产生抗病性。
文档编号C12N15/82GK102094026SQ201010575259
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者李玉蓉, 车亦舟, 邹丽芳, 邹华松, 陈功友 申请人:上海交通大学