专利名称：一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及SiRNA双链序列及其应用，尤其是抑制Hmga2基因表达的双链siRNA 及其抗肿瘤应用。
背景技术：
RNAi是一种在生物体细胞内，由特异的内源性或外源性双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)诱发其同源mRNA降解的基因沉默机制。RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因mRNA存在同源互补序列的dsRNA 导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，产生相应的功能表型缺失。RNAi首先由Fire等发现于秀丽隐杆线虫中，他们发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又将RNAi称为转录后基因沉默(PTGS) [Fire et al. ,1998, FEBS Lett. 2007 Jul]。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、 无脊椎动物，甚至哺乳动物。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的是21 23个碱基大小， 3’端有两个突出碱基的siRNA。RNAi是dsRNA介导的转录后沉默，具有强大的细胞穿透能力，可在不同细胞间长距离传递和维持。RNAi效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。 siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。因此，有效的RNAi依赖于siRNA的准确设计。siRNA的基因沉默效应取决于其靶基因序列的选择，任一碱基的错配都会导致RNAi效率减弱甚至丧失，这种高度的序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因沉默具有明显的药理作用。siRNA主要通过脂质体转染、电穿孔、微注射以及质粒、病毒载体导入。RNAi技术发展至今已经超过10年，其在肿瘤中的研究也已经展开，RNAi的靶基因包括癌基因、甲基化相关基因、旁分泌/自分泌环、抗凋亡基因、血管形成相关基因、组织基质金属蛋白酶家族、细胞周期调控相关基因、癌转移相关基因、多药耐药相关基因等[Phalon et al. Expert Rev Mol Med. 2010 Aug 18; 12 :e26 ；Vazquez-Vega et al. Rev Invest Clin. 2010 ；62(1) :81-90]。Hmga2是人Hmga基因家族的3个主要成员之一。HMGA蛋白家族是一类以AT-hooks 的高度保守的DNA结合基序和一个酸性拖尾为特征的小分子非组蛋白染色体蛋白。它们通过识别特定的DNA结构而不是一种特异的核苷酸序列来优先地结合到DNA中AT丰富的小沟内。由于HMGA蛋白家族具有通过改变染色体结构而调节很多目的基因表达的能力，使其通常被认为是结构性转录因子[Reeveset al. Environ Health Perspect，2000，108 (Suppl 5) :803-809]。HMGA参与转录调节、胚胎形成、分化、致瘤性转化、病毒基因组的整合和表达等不同的生物学过程。人的Hmga2基因位于12号染色体的ql5区，5个外显子的跨度接近1601Λ，蛋白结构由109个氨基酸组成，其中外显子1、2、3编码的序列中各含一个AT hook。外显子4和5 分别编码连接区和酸性区。这三个碱性八肽的DNA结合基序都能与DNA分子小沟内的AT 丰富区结合，因而称为AT hook,其核心结构是BBXRGRXB (B代表碱性氨基酸K或R，X是甘氨酸或脯氨酸)。其中基序中间的保守RGR序列在HMGA2与DNA结合中至关重要。尽管单个DNA结合基序的结合特异性不高，但是如果结合其上的DNA存在间隔一定序列的AT丰富区，则由于多个基序与一个DNA分子结合而使亲和力大大提高。HMGA2在正常生理活动中发挥着重要作用，当它出现异常时，就会导致疾病发生。 1985年，在被病毒转化的大鼠甲状腺细胞株中，Giancotti发现了 HMGA2，并首次将它与肿瘤联系起来[Giancotti et al. Cancer Res, 1985,45(12 Pt 1) :6051-6057]。后期研究认为，HMGA2基因重排产生的突变蛋白与良性肿瘤有关，如脂肪瘤、肺部软骨错构瘤、多形性腺瘤、子宫平滑肌瘤；而全长蛋白过表达与恶性肿瘤发生发展有关。Hmga2在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等大多数恶性肿瘤中均过表达，HMGA2蛋白的含量与肿瘤的进展相关。Hmga2 是最近国内外研究较多的一个基因，除了在多种肿瘤中过度表达外，还与 Μ分期、淋巴结转移等肿瘤事件息息相关，并被认为在表皮间质转化(EMT)过程中起到重要作用。它可以调控包括Snaill、Snail2、Twist、Id2等蛋白的转录从而影响EMT进程[Thuault etal. J Cell Biol,2006,174(2) :175-183]。目前，针对HMGA2的研究逐渐增多，HMGA2参与多个与肿瘤发生发展相关的生理病理过程，因此，HMGA2有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。针对Hmga2展开治疗的主要手段有反义核苷酸和RNAi干扰技术。Pentimalli等用腺病毒携带HMGA2反义核苷酸进入高分化脂肪肉瘤细胞，能够引起HMGA2阳性细胞的生长抑制，并诱导其凋亡，但对HMGA2阴性的癌细胞则没有相应作用[Pentimalli et al. Cancer Res, 2003,63 (21) :7423-7427.]。 Malek等用siRNA沉默HMGA2 (1146-1164)，能够导致卵巢癌细胞株周期阻滞与凋亡，还能够抑制0vcar-3细胞在小鼠体内移植瘤的生长[Malek et al. Int J Cancer, 2008,123 (2) 348-356. ]。siRNA还被用于沉默胚胎干细胞中Hmga2基因的表达。此外，HMGA23，UTR具有众多的microRNA结合位点，特别是7个保守的Let_7结合位点，为针对HMGA2的microRNA 药物开发提供了合适的靶点。Yu等就使用let-7来抑制HMGA2，从而抑制乳腺癌的发生[Yu et al. Cell，2007，131(6) :1109-1123]。本发明设计提供了一组针对Hmga2基因的s iRNA，通过筛选得到Hmga2 siRNAl (990-1008)、Hmga2 siRNA2 (1051-1069)、Hmga2 siRNA3 (1113-1131)三对新的有效 siRNA序列。所说三对针对Hmga2的siRNA，不但能直接抑制多种肿瘤细胞的增殖，还有削弱内皮细胞的增殖和迁移的能力。因此，本发明提供的三对新的有效siRNA可以从抗肿瘤本身和抗血管形成两个方面发挥治疗作用，具有广谱抗肿瘤功效。本发明提供的所述三对针对Hmga2的siRNA，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用。三对 siRNAl、2、3序列都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。为了达成上述目的，本发明的解决方案是一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，该序列为下列序列中的任意一条或一条以上； SiRNAl 正义链 5，-UGGCCACAACAA⑶UGUUCtt-3，，反义链 5，-GAACAACUU⑶UGUGGCCAtt-3，；siRNA2 正义链 5，_AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt_3，，
反义链 5，-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3，；siRNA3 正义链 5，_GGAGGAAACUGAAGAGACAtt_3，，反义链 5，-UGUCUCUUCA⑶UUCCUCCtt-3，。一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA用于制造治疗肿瘤的药物。本发明的有益效果为本发明针对Hmga2(NM_003483)基因设计了一组siRNA，筛选出三对siRNA序列可以抑制Hmga2基因和蛋白的表达。通过脂质体将合成的siRNA转入 A549, NCI-H446、SPC-Al等肿瘤细胞株以及HUEVC、EVC-304血管内皮细胞株，设立对照组。 经过MTT法检测siRNA双链对肿瘤细胞和血管内皮细胞生长的抑制，用Hoechst 33258染色检测siRNA对肿瘤细胞凋亡的影响，用RT-PCR验证siRNA对Hmga2表达的抑制作用。通过血管内皮细胞迁移实验检测siRNA对HUEVC和EVC304迁移能力的影响。结果表明MTT 显示Hmga2三对siRNAl、2、3对肿瘤细胞和血管内皮细胞的抑制作用与对照组相比，均有显著性差异(P < 0. 05)，其中以Hmga2 siRNA3的抑制作用最为明显。RT-PCR证实，Hmga2 siRNAl、2、3对AM9、NCI_H44、HUEVC中的Hmga2 mRNA都具有明显的抑制作用，其中，Hmga2 siRNA3对NCI-H446中Hmga2 mRNA的干扰作用最为明显。细胞迁移实验表明，Hmga2 siRNA 1、2、3都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移。本发明提供的Hmga2 siRNA不但能用于体外培养细胞的RNAi，同时也能用于体内实验，是很好的治疗肿瘤的药物。
图1为本发明Hgma2 siRNA3转染入细胞的荧光照片；其中A-A549细胞；B-NCI-H446 ；C-SPC-Al图2为本发明Hmga2 siRNA对A549细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图3为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞数量的影响形态学观察；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图4为本发明Hmga2 siRNA对SPC-A1细胞数量的影响形态学观察；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图5为本发明Hmga2 siRNAl、2、3对EVC-304细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图6为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图7为本发明Hmga2 siRNA对A549细胞增殖能力的影响；其中1-对照；2-siRNAl；3_siRNA2 ；4_siRNA3 ；ES "72h _，-96h图8为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞增殖能力的影响(96h)；其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；4-对照图9为本发明Hmga2 siRNA对SPC-A1细胞增殖能力的影响(96h)；其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；4-对照图10为本发明Hmga2 siRNA对EVC-304细胞增殖能力的影响(96h)；
其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；4-对照图11为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC细胞增殖能力的影响(96h)；其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；4-对照图12为本发明Hmga2 siRNA对A549肿瘤细胞迁移能力的影响；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图13为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞迁移能力的影响；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图14为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC血管内皮细胞迁移能力的影响；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图15为本发明Hmga2 siRNA对肺腺癌细胞系A549 (左)和NCI-H446 (右)Hmga2 mRNA水平的影响；其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；C-对照；A_Hmga2 ；B-18S RNA图16为本发明Hmga2 siRNA3对血管内皮细胞系HUEVC Hmga2 mRNA水平的影响；其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA3图17为本发明Hmga2 siRNA对EVC-304细胞小管形成能力的影响。其中A-对照；B-siRNAl；C_siRNA2 ；D_siRNA具体实施例方式实施例1抑制Hmga2基因表达的siRNA设计siRNA 采用 Clontech 公司软件，(http://bioinfo. clontech. com/rnaidesiRner/)。人 Hmga2(NM_003483)基因编石马序列由 Entrez Gene (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. (fcgi ？ db = Rene)查找获得，输入编码区并选择限定条件，得到目的序列后进行BLAST分析，确定无同源序列的siRNA作为目的序列。siRNA序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和鸟嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。 阴性对照序列由上海吉玛公司提供。筛选得到针对Hmag2基因的3对Hmga2 siRNA以及对照siRNA如下Hmga2 siRNA 处理 96h 后，细胞培养液中加入 10 μ 1 5mg/ml MTT,Hmga2 siRNAl 正义链 5，-UGGCCACAACAA⑶UGUUCtt-3，seq. 1反义链 5，-GAACAACUU⑶UGUGGCCAtt-3，seq. 2Hmga2 siRNA2 正义链 5，_AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt_3，seq. 3反义链 5，-UUCUCCA⑶GGCUUCUGCUtt-3，seq. 4Hmga2 siRNA3 正义链 5，_GGAGGAAACUGAAGAGACAtt_3，seq. 5
反义链 5，-UGUCUCUUCA⑶UUCCUCCtt-3’Control siRNA 正义链
seq. 6
5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUtt-3’ seq. 7反义链 5，-AC⑶GACACUGGCGGAGAAtt-3，seq.8继续培养4h后吸弃培养液，每孔加入100 μ 1 DMS0,震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪490nm处测OD值，以630nm作为参比波长，按下列公式计算相对增殖率。
权利要求
1.一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，其特征是该序列为下列序列中的任意一条或一条以上；siRNAl 正义链 5，-UGGCCACAACAA⑶UGUUCtt-3，，反义链 5，-GAACAACUU⑶UGUGGCCAtt-3’ ； siRNA2 正义链 5，-AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt-3，，反义链 5，-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3，； siRNA3 正义链 5，-GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3，， 反义链 5，-UGUCUCUUCAGUUUCCUCCtt-3，。
2.如权利要求1所述的一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA用于制造治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明公开了一种siRNA序列，具体为一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA序列，三对siRNA1、2、3序列都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。
文档编号C12N15/113GK102174514SQ20101057523
公开日2011年9月7日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者刁勇, 王启钊, 许瑞安 申请人:华侨大学