专利名称：一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的 检测试剂。
背景技术：
登革病毒属黄病毒属，为单股正链RNA病毒，可导致登革热(DF)、登革出血热 (DHF)和登革休克综合征(DSQ。登革病毒病每年约有5-10千万人感染，已成为全球公共卫 生关注的焦点之一。本病感染潜伏期为2 15天，平均5 6天，通常3 5天，发病前尽 管体内有病毒存在，而前驱症状却不明显。登革热表现为突然起病，畏寒、迅速发热等症状。 登革出血热有典型登革热表现，2 4病日内可见散在出血点。病情进展中有鼻腔、牙龈、消 化道、泌尿道或子宫等任何一个以上器官的较大量出血，常见肝肿大，脑出血的病例也有发 现。异常严重出血的病例可导致死亡。登革休克综合征具有DHF表现的少数病人，在发热 过程中或热退后，病情突然加重，出现皮肤湿冷、脉数弱、烦燥或昏迷，血压下降出现休克或 脉压低于2. 67Kpa(20mm汞柱以下)等危象，甚至血压和脉搏测不出，病情凶险，病死率高。登革热的诊断目前主要采取病毒分离定型以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定 的方法。但由于患者早期抗体阳性率低，往往要7-10d后IgM抗体才能达到一个较高的水 平，因此在早期诊断中受到一定的限制。近年来发展起来的荧光定量RT-PCR技术可实现早 期诊断，而且与常规PCR相比，荧光定量PCR方法更灵敏，且不需要电泳分析，同时因加入特 异的荧光标记探针可对PCR扩增产物进行实时检测，因而更省时、特异，减少了交叉污染， 并能精确地对多个样本进行定量分析。在以往的研究中有在登革1型病毒3’非编码区(3’ NC)、NS5区、衣壳蛋白(C)区 域设计引物探针。目前一般认为3’NC和NS5区设计的引物探针敏感性较差；C区保守性较 差，设计出来的引物探针容易受到其它三型登革病毒的干扰；E区变异性很大，会出现假阴 性或者敏感性较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种登革1型病毒的荧光定量PCR检测试剂盒， 该试剂盒对登革1型病毒具有特异性和敏感性好的优点。本发明解决上述问题的技术方案具体是一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR 试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、一对特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物、荧光探 针、荧光定量聚合酶I^remix Ex Taq 和参比染料ROX Reference Dye II组成，其特征在 于(1)所述的引物是特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物，其中，上游引物序列为5，-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3，(SEQNO. 1)，下游引物序列为5，-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3，(SEQNO. 2)；(2)所述的荧光探针序列为
5，FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3，(SEQ NO. 3),其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，Eclipse为标记在探针3’端的荧光淬 灭基团；(3)所述的定量阳性模板为含有下列DNA片段的pMDIS-T重组质粒GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAAT GGGACAACTGA(SEQ NO. 4)。本发明所述的特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物可以由本领域常用的方 法合成。本发明所述的荧光探针可以由本领域常用的方法合成。本发明所述的荧光定量聚合酶I^remix Ex Taq 由Takara公司提供、参比染料 ROXReference Dye II 由 Takara 公司提供。本发明所述的定量阳性模板的构建方法是将DNA片段SEQ NO. 4插入到质粒载体 中构建重组质粒得到。上述方法中，所述的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段 SEQ NO. 4插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质 粒载体而定。登革病毒非结构蛋白NS2A可能参与多聚蛋白的水解过程，本发明人通过Clustal W2对不同株的登革病毒基因进行比对，发现四型登革病毒在NS2A基因处的差别较大，而且 与其它黄热病毒之间也存在很大差别，同时登革1型病毒型内的NS2A基因则比较保守，本 发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断病人是否被登革1型病毒感染，扩增的引物序列 为SEQ NO. 1和SEQ N0. 2，其位置如
图1示。本发明所述的试剂盒的使用方法为(1) Real-time PCR，反应体系如下表1本发明试剂盒Real-Time PCR反应体系
权利要求
1. 一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、一对特异 性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物、荧光探针、荧光定量聚合酶ft~emiX Ex Taq 和参比 染料ROX Reference Dye II组成，其特征在于(1)所述的引物是特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物，其中， 上游引物序列为5，-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3，，下游引物序列为5’ -TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3，；(2)所述的荧光探针序列为5’ FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3，，其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，Eclipse为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；(3)所述的定量阳性模板为序列为SEQNO. 4的DNA片段的pMD19_T重组质粒，GATGAG ATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA。
全文摘要
本发明属于生物化学领域，提供一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ NO.1)，5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ NO.2)；和荧光探针5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ NO.3)。该试剂盒对登革1型病毒具有良好的敏感性和特异性，重复性很好，完全适用于登革1型病毒的临床检测。
文档编号C12Q1/68GK102108420SQ20101057521
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者万成松, 曹虹, 朱利, 熊建英, 赵卫, 马丹娟 申请人:南方医科大学