通过厌氧微生物的共生共培养物从合成气生产含有n-丙醇和其他C3的产物的方法
【专利摘要】本发明提供了生产丙醇的方法和系统。具体而言，本发明的方法和系统使用共生共培养物用于从合成气生产丙醇。
【专利说明】通过厌氧微生物的共生共培养物从合成气生产含有η-丙醇和 其他C3的产物的方法 发明领域
[0001] 本发明提供了使用厌氧微生物的共生共培养物从合成气生产含有η-丙醇和其他 C3的产物的方法和系统。
[0002] 发明背景
[0003] 丙醇是工业上使用的溶剂，但更重要地，其可以容易地脱水以生产丙烯，丙烯是世 界上第二大化学商品，每年生产>7千万吨。目前丙烯主要通过石脑油或液体石油气的蒸汽 裂化或气油的流体催化裂化在非常大的设施中作为次级产物生产。蒸汽裂化是制备大多数 乙烯和许多其他共产物，诸如丁烯、丁二烯和热解汽油的方法，所述产物全部需要同时纯化 和利用。制备丙烯的其他方法是精炼厂FCC(流体催化裂化），在此丙烯是来自重气油的副产 物，比例在3和15wt%之间。也可以通过丙烷的催化脱氢生产丙烯。制备丙烯的另一种方法 是经由丁烯与乙烯的置换作用。
[0004] 许多世纪以来，在酿酒酵母的帮助下将简单的糖发酵为乙醇。已经开发了最近十 年的从纤维素和半纤维素开始的新途径以将更复杂的碳水化合物发酵为乙醇。对此，碳水 化合物需要从木质纤维素生物质释放。生物质约由30%纤维素、35%半纤维素和25%木质 素组成。木质素级分不能作为乙醇定价，因为其芳香性质，并且仅可以作为能源使用，其在 许多情况中对于运行工厂过量存在。
[0005] 若干微生物能够使用一碳化合物作为碳源并且一些甚至作为能源。二氧化碳是光 养菌、硫酸盐还原菌、产甲烷菌、产乙酸菌和化学无机营养微生物的重要碳源。基本上有4种 固定C0 2的系统：⑴卡尔文循环[C02固定酶:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶]，（2)还原性柠檬酸 循环[C02固定酶:2-酮戊二酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合酶]，（3)乙酰-CoA途径[C02固 定酶：乙酰-CoA合酶，与C0-脱氢酶相联]和(4) 3-羟基丙酸循环[C02固定酶：乙酰-CoA羧化 酉每，丙酉先-CoA 駿化酉每]("Structural and functional relationships in Prokaryotes'，， L. Barton , Springer 2005;"Carbon monoxide-dependent energy metabolism in anaerobic bacteria and archaea"，E.Oelgeschelager，M.Rother，Arch.Microbiol·， 190,第257页，2008;"Life with carbon monoxide"，S·Ragsdale，Critical Reviews in Biochem.and Mol.Biology，39，第165页，2004)。
[0006] 最近正在开发更有效率的途径，所述途径从含碳的材料生产合成气并随后将其发 酉孝为乙酉享（"Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels'，， K.KlassonjM.AckersorijE.Clausen,J.Gaddy,Enzyme and Microbial Technology，14(8)， 第602页，1992;"Fermentation of Biomass-Generated Producer Gas to Ethanol"， R.Datar，R.Shenkman，B.Cateni，R.Huhnke，R.Lewis，Biotechnology and Bioengineering，86(5)，第587页，2004;"Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production"，A.Hemstra，J.Sipma，A.Rinzema，A.Stams，Current Opinion in Biotechnology，18,第200页，2007;"Old Acetogens，New Light"，H.Drake，A· G&finer，S.Daniel，Ann.N.Y. Acad. Sci. 1125:100-128,2008)〇
[0007]合成气可以通过整个生物质的气化生产而无需释放某些级份。合成气也可以从其 他原料经由气化：（i)煤，（ii)市政废品，（iii)塑料废品，（iv)石油焦和(V)来自精炼厂或来 自纸工业的液体残余物（黑液)生产。合成气也可以从天然气经由蒸汽重整或自热重整（部 分氧化)生产。
[0008]合成气转化的生物化学途径由Wood-Ljungdahl途径描述。合成气的发酵提供了若 干优势，诸如生物催化剂的高特异性，较低的能量成本(因为低压和低温生物转化条件），对 生物催化剂中毒的更大的抗性和对预先设定的出比⑶比率几乎没有限制（"Reactor design issues for synthesis-gas fermentations^M.Bredwel1,P. Srivastava, R.Worden,Bi〇technology Progress 15，834-844，1999;"Biological conversion of synthesis gas into fue1s"，K·Klasson，C·Ackerson，E·Clausen，J·Gaddy， International Journal of Hydrogen Energy 17,第281 页，1992)。产乙酸菌是能够将合 成气组分，如CO, C〇2和H2经由还原性乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径转化为乙酸盐的一组 厌氧细菌。
[0009] 已经分离了具有将合成气发酵为乙醇、乙酸和其他有用终产物的能力的若干种厌 氧细菌。扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)和Clostridium autoethanogenum，是首先 得知的将CO，C02和H2转化为乙醇和乙酸的生物中的两种。通常称为同型产乙酸菌的这些微 生物具有将 C〇2还原为乙酸盐以生产所需要的能量和生产细胞团的能力。使用合成气组分 的三种不同组合的乙醇合成的总体化学计量学如下（J.Vega, S. Prieto，B . Elmore， E·Clausen，J.Gaddy，"The Biological Production of Ethanol from Synthesis Gas"， Applied Biochemistry and Biotechnology,20-1，第781页，1989):
[0010] 6CO+3H2O^CH3CH2〇H+4C〇2
[0011] 2C〇2+6H2^CH3CH2OH+3H2〇
[0012] 6CO+6H2^2CH3CH2OH+2C〇2
[0013] 根据先前给出的前两个反应，原理上通过同型产乙酸菌的CO和/或出和0)2的发酵 而生产的主要产物是乙醇。同型产乙酸菌也可以生产乙酸盐。乙酸盐生产经由以下反应发 生：
[0014] 4C0+2H20^CH3C00H+2C02
[0015] 4H2+2C02^CH3C00H+2H20
[0016]扬氏梭菌，最先已知将合成气发酵为乙醇的自养微生物之一，于1987分离，作为同 型产乙酸菌其在其活跃生长期喜好生产乙酸盐(产乙酸）而乙醇主要作为非生长相关产物 生产(溶剂产生）（"Biological conversion of synthesis gas into fuels'，，K.Klasson， C.Ackerson,E. Clausen,J.Gaddy, International Journal of Hydrogen Energy 17,第 281 页，1992)。
[0017] Clostridium autoethanogenum是严格厌氧的、革兰氏阳性的、成孢子的、棒状的、 运动细菌，其代谢C0以形成乙醇、乙酸盐和C02作为终产物，除其使用0)2和出、丙酮酸盐、木 糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖和L-谷氨酸盐作为底物的能力外(J.Atoi ni，H.Naveau，E.Nyns， "Clostridium autoethanogenum，Sp-Nov，an Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol from Carbon-Monoxide"，Archives of Microbiology，161(4)，第345页，1994)〇
[0018]厌氧产乙酸微生物提供了经由发酵方法将废气，诸如合成气，转化为有用的产物， 诸如乙醇的可行的途径。此类细菌以比通过传统生产方法可达到的更高的特异性，更高的 收率和更低的能量成本催化出和〇)2和/或C0转化为酸和/或醇。尽管在乙醇发酵中利用的许 多厌氧微生物也生产少量的丙醇作为副产物，迄今，尚没有描述一种能够利用发酵方法以 生产高收率的丙醇的厌氧微生物。
[0019] 因此本领域仍然需要在使用出和〇)2和/或C0的底物发酵生产丙醇中使用微生物的 方法。 发明总结
[0020] 最广义地，已经发现了生产丙醇和/或丙酸的方法，所述方法包括在共生共培养物 有效将气体底物转化为丙醇和/或丙酸的条件下将选自一氧化碳、二氧化碳和氢气或其组 合的气体底物暴露给包含固定C1的微生物和生产C3的微生物的共生共培养物。在大多数情 况下气体底物是合成气并且生产C3的微生物是产丙酸菌。
[0021] 在更有限的形式中，已经发现了用于将合成气转化为丙醇和/或丙酸的厌氧共生 系统，该系统包含合成气、培养基、固定C1的微生物和生产C3的微生物。通常，在本发明的这 种形式中，生产C3的微生物同样是产丙酸菌。
[0022] 附图简述
[0023] 本发明的这些和其他目的、特征和实施方式将从以下详细描述与附图的组合中更 好地理解，其中：
[0024] 图1是本发明的厌氧微生物培养物的共生关联的实施方式的示意图。固定C1的微 生物从合成气生产乙醇和乙酸盐。共生的生产C3的微生物将乙醇、乙酸盐和（其次地)H 2/ C0/C02转化为含有C3的产物，即丙酸盐和丙醇。固定Cl的微生物也将丙酸盐转化为丙醇，丙 醇变为主要终产物。
[0025] 图2是厌氧微生物所使用的用于C3(丙酸盐)生产的甲基丙二酰-琥珀酸途径的详 细说明。
[0026] 图3是厌氧微生物所使用的用于C3(丙酸盐/丙醇)生产的乳酸-丙烯酸途径的详细 说明。
[0027]发明详述
[0028]本发明提供了通过厌氧微生物的共生培养物从合成气生产含有丙醇和其他C3的 产物的方法。在其他方面，本发明提供了用于将合成气转化为丙醇的厌氧系统。
[0029]如本文所用，合成气（synthesis gas)(合成气（syngas))是含有一氧化碳、二氧化 碳和通常氢气的气体。"合成气"包括这样的气流，其含有二氧化碳与氢气的组合并且可包 括少量或不包括一氧化碳。"合成气"也可以包括可有少量或没有氢气的一氧化碳气流。
[0030] 如本文所用，术语"共生的"指两种或多种不同类型（例如，生物、种群、株、种、属、 科等）的厌氧微生物的关联，所述厌氧微生物能够形成紧密关联的代谢共生。如本文所用， 术语微生物的"共培养物"指共生微生物的联合孵育或共同孵育。在本发明的上下文中，在 共生微生物的联合孵育期间共培养物不需要细胞群生长。
[0031] 在图1中说明的本发明的实施方式中，利用两类厌氧微生物以创造共生共培养物 用于生产丙醇。共生共培养物中的第一类微生物是主要的固定C1的微生物，其利用合成气 作为唯一碳源和电子源并且生产乙醇和乙酸盐作为异化代谢产物。共生共培养物中的第二 类微生物能够在固定Cl的微生物的异化代谢物（乙醇和乙酸盐)上生长作为其唯一碳源和/ 或电子源以生产C3碳分子，诸如丙醇或丙酸，作为其主要产物或连同合成气(作为额外的碳 和/或电子源)将固定C1碳的微生物的代谢物转化为C3碳分子。该第二种微生物在本文应当 称为生产C3微生物。有利地，固定C1的微生物也可以能够将由生产C3的微生物生产的丙酸 盐转化为丙醇。
[0032]本发明的固定C1的微生物也是同型产乙酸菌。在厌氧条件下，同型产乙酸菌具有 从底物，C0+H20，或H2+C〇2或C0+H2+C02生产乙酸和乙醇的能力。C0或C〇2提供了碳源并且H 2或 C0提供了电子源，用于生产乙酸和乙醇的反应。根据先前给出的两个反应由同型产乙酸菌 通过C0和/或出和〇)2的发酵所生产的主要产物原理上是乙醇，如此使得固定C1的微生物充 当了使用乙酰-CoA途径的产溶剂同型产乙酸菌。
[0033] 适用于本发明方法中的固定C1的微生物包括，但不限于，同型产乙酸菌诸如扬氏 梭菌，Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei,和Clostridium coskatii。适用于本发明的额外的固定Cl的微生物包括Alkal ibaculum bacchi， Clostridium thermoaceticum，和乙酉爱梭菌（Clostridium aceticum) 〇
[0034] 在本发明中，共生的生产C3的微生物能够在作为其主要碳源的乙醇和/或乙酸盐 上生长。这些微生物包括，但不限于以上描述的生物及其途径并且包括，丙酸暗杆菌 (Pelobacter propionicus)、Clostridium neopropionicum、丙酉爱梭菌（Clostridium propionicum)、丙酸脱硫叶菌（Desulfobulbus propionicus)、沃氏共养杆菌 (Syntrophobacter wol ini i )、普氏共养杆菌（Syntrophobacter pfennigii)、 Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、Desulfotomaculum thermobenzoicum subspecies thermosyntrophicum、 Pelotomaculum 1±61'1]1〇卩1'〇卩;[011；[(311111、和卩6101:01]1&(3111111118(311；[111<1;[。在本发明特另1」的实施方 式中，生产C3的微生物是产丙酸菌。产丙酸菌指能够将合成气中间物，诸如乙醇和乙酸盐， 转化为丙酸和丙醇的任何微生物。本发明的产丙酸菌利用用于将合成气转化为丙酸盐的至 少两种不同途径中的一种：甲基丙二酰-琥珀酸途径（图2中显示)和乳酸-丙烯酸途径（图3 中显示）。
[0035]已经显示使用二羧酸途径的丙酸暗杆菌在作为底物的乙醇上生产同时在C02存在 下生产丙酉爱盐（Schink，B.，Kremer，D.和Hansen，T.，"Pathway of propionate formation from ethanol in Pelobacter propionicus"，Arch.Microbiol·147，321-327，1987和 S·Seeliger，P·Janssen，B·Schink，"Energetics and kinetics of lactate fermentation to acetate and propionate via methylmalonyl-CoA or acrylyl-CoA"， FEMS Microbiology Letters，211，第65-70页，2002)。当将乙醇与C02和氢气共同进料时， 生产显著量的丙醇。乙醇转化为乙酰-CoA(经由乙醛）同时生产电子用于乙酰-CoA羧化为丙 酮酸盐，由丙酮酸合酶催化。与二羧酸途径组合，从乙醇和⑶2生产丙酸盐（Schink等人， 1987) 〇
[0036] 3 乙醇+2HC03--2 丙酸盐-+乙酸盐-+H++3H20
[0037]丙酸暗杆菌不能将乙酸盐和C02还原性地转化为丙酸盐然而丙酸脱硫叶菌从乙酸 盐和C〇2制造丙酸盐(Schink等人，1987).
[0038]乙酸盐-+HC03-+3H24 丙酸盐-+3H20
[0039] 使用丙稀酸盐途径的Clostridium neopropionicum(菌株X4)能够将乙醇和C〇2转 化为乙酸盐、丙酸盐和一些丙醇（]\!11〇1〇2&11，]\1'〇112613.3&1]1&；[11，]\61'；[￥61：，6.?代11816『 and G·Albagnac，"Clostridium neopropionicum sp. Nov ., a strict anaerobic bacterium fermenting ethanol to propionate through acrylate pathway"， Arch .Microbiol.，157，第249-257页，1992)。对于二羧酸途径，从底物乙醇生产的中间物乙 酰-CoA经由丙酮酸合酶连接至丙烯酸盐途径，所述丙酮酸合酶将乙酰-CoA通过与C0 2羧化 转化为丙酮酸盐。
[0040] 因此，当本发明的共生培养物具有在空间上分离的共生关系中或作为共培养物从 气态碳和电子源生产η-丙醇的能力。培养物的适当的碳和电子源的来源包括"废"气诸如合 成气、油精炼废气、制钢废气、蒸汽产生的气体、天然气或石脑油的自热或组合重整、生物质 的生物气和产物、煤或精炼残余物的气化或后者的混合物。来源可包括气体(含有一些Η2)， 其是通过酵母、梭菌发酵生产的、和气化的纤维素材料。此类气态底物可作为其他过程的副 产物生产或可特异性地生产用于本发明的方法中。本领域技术人员将认识到底物气体的任 何来源可用于本发明的实践中，只要能够在适于细菌实施发酵反应的条件下为共培养物的 微生物培养物提供充足量的底物气体。
[0041] 在本发明的一个优选的实施方案中，C0、C02和出的来源是合成气。用作底物的合成 气可例如，作为煤或精炼残余物的气化的气态产物获得。也可以通过重整天然气或石脑油， 例如通过在蒸汽甲烷重整器中重整天然气生产合成气。备选地，可以通过明确用于细菌发 酵目的的容易获得的低成本农业原材料的气化生产合成气，从而提供将生物质间接发酵为 醇的途径。存在多种能够转化为合成气的原材料的实例，因为多数类型的植物可用于此目 的。适当的原材料包括，但不限于，多年生牧草诸如柳枝稷、作物残余物诸如玉米秸、加工废 料诸如锯肩、来自甘蔗收获(甘蔗渣)或棕榈油生产的副产物，等。本领域技术人员熟知从此 类起始材料生成合成气。一般而言，在气化炉中主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整从干燥 的生物质生成合成气，主要产物是〇)，出和0) 2。术语"气化"和"热解"指相似的过程;两个过 程均限制生物质所暴露于的氧气的量。术语"气化"有时用于包括气化和热解两者。
[0042] 也可以使用进料入发酵过程中的底物气体的组合来源以改变生物反应器的进料 气流中组分的浓度。例如，C0，C02和H 2的主要来源可以为通常展示出37%0)，35%出，和18% C02的浓度比例的合成气，但合成气也可以补充有来自其他来源的气体以富集C0(即，乳钢 废气富含C0)或出的水平。
[0043]本发明的共生共培养物必须在厌氧条件下培养。如本文所用，"厌氧条件"意为在 微生物所暴露的环境的气相中氧气(02)的水平低于百万分之0.5。本领域技术人员将熟悉 用于培养这些微生物的标准厌氧技术(Balch和Wolfe，1976，Appl .Environ.Microbiol ·32: 781-791;Balch等人，1979，Microbiol.Rev. 43: 260-296)。这些培养技术需要厌氧室用于制 备培养材料和气体交换歧管以建立对于密封的管或容器中的培养物的理想的气相。
[0044] 目前，在自然环境中尚未发现能够从合成气生产丙醇或丙酸的天然共生配对物。 然而，当在正确的养分条件和选择压力下共同配对时，可以迫使来自自然环境的微生物形 成这些"非天然的"代谢共生配对物，其将从合成气生产丙醇。
[0045] 可以以若干种方式生成用于本发明的共生培养物。一种方法涉及使用养分选择压 力以在含有混合的厌氧微生物群落的环境样品中发现的微生物中的至少两种之间形成代 谢共生。在此方法中，微生物生长可用的唯一碳和电子源是合成气和/或合成气发酵产物， 诸如乙醇和乙酸盐。在这些养分选择压力下，能够在这些养分上生长的微生物将富集。
[0046] 用于形成上述共生关联的方法的变化涉及稀释。该方法允许样品中生产C3的产丙 酸菌非常缓慢生长以达到较高的细胞密度。富集培养物的稀释可以用连续进料的厌氧发酵 罐进行或通过富集样品的系列稀释手动进行。这两种稀释技术施加相同的前述碳和电子源 的养分选择压力。
[0047] 建立能够将合成气转化为丙醇的共生关联的另一方法涉及培养两个或多个确定 的培养物并建立这些单独培养物的配对。本领域技术人员将理解有多种配对两个或多个确 定的培养物的方法。例如，一种方法涉及首先在发酵罐中培养已知的固定C1的同型产乙酸 菌，以合成气作为唯一的碳和电子源。在优选的实施方式中，同型产乙酸菌将生产乙醇并 且，同时，在单独的发酵罐区中培养已知的生产C3的产丙酸菌培养物。一旦同型产乙酸菌关 于乙醇和/或乙酸盐生产力已经达到稳态，在发酵罐中接种已知的生产C3的产丙酸菌培养 物。
[0048]配对的另一种方法涉及首先在发酵罐中生长生产C3的产丙酸菌直到已经达到丙 酸+丙醇的最大生产率目标。发酵的此阶段合成气应当作为曝气以使得培养物适应合成气 并提供C02用于丙酸生产。一旦已经达到最大生产率目标，直接向含有生产C3的培养物的发 酵罐中加入固定C1的同型产乙酸菌的种子培养物。逐渐增加合成气传质到发酵容器以平衡 固定C1的同型产乙酸菌的气体消耗。用于生长生产C3的产丙酸菌的乙醇或乙酸盐逐渐降低 至〇因为固定C1的同型产乙酸菌开始提供此底物。建立共生培养物的此上一方法的修改涉 及首先在具有静态的或在发酵罐内漂浮的生物膜支持材料的发酵罐中生长生产C3的产丙 酸菌培养物。在此以其整体并入的美国专利公开20090035848显示了在移动床生物反应器 中使用漂浮的支持材料。此类支持材料的实例是Mutag Biochips。此方法允许生产C3的微 生物首先在载体材料上建立生物膜，从而增加细胞保留时间对发酵罐的水力停留。同样地， 在用固定C1的同型产乙酸菌接种发酵罐之前达到目标丙酸生产率。
[0049] 建立能够从合成气生产丙醇的共生培养物的最后一个方法涉及初始共同混合两 个或多个培养物，其中之一是能够在合成气上生长并且生产乙醇和乙酸盐的固定C1的同型 产乙酸菌。另外的培养物是能够将乙醇或乙酸盐转化为丙酸的生产C3的产丙酸菌。乙醇或 乙酸盐进料可以逐渐降低至〇因为这些底物由固定C1的同型产乙酸菌的生产增加以平衡底 物消耗。
[0050] 用于生长和维持共生共培养物或用于顺序发酵的单独培养的培养物的适当的培 养基组合物，包括确定的培养基制剂。从储液制备标准生长培养基，这导致以下最终成分每 升培养基。给出的量为克除非另外声明。矿物质:NaCl，2;NH4Cl，25;KCl，2.5;KH 2P〇4,2.5; MgS〇4 · 7H20,0.5;CaCl2 · 2Η20,0·1。痕量金属：MnS〇4 · H2〇,0.01;Fe(NH4)2(S〇4)2 · 6H20， 0.008；C〇C12 · 6H20,0.002；ZnS04 · 7H20,0.01；NiCl2 · 6H20,0.002；Na2Mo04· 2H20, 0.0002, Na2Se〇4,0· 001，Na2TO4,0· 002。维生素（量，mg):吡哆醇 HC1,0.10;硫胺素 HC1,0.05， 核黄素，0.05;泛酸钙，0.05;硫辛酸，0.05; p-氨基苯甲酸，0.05;烟酸，0.05;维生素 B12， 0.05;巯基乙醇磺酸，0.05;生物素，0.02;叶酸，0.02。以半胱氨酸(游离碱），0.1;和Na2S · 2H20,0.1的终浓度(g/L)向培养基添加还原剂混合物。培养基成分也可以由酵母提取物或 玉米浆提供或用此类液体补充。
[0051] 本发明的方法可以在本领域技术人员所知的若干类型的发酵装置中的任一种中 进行，具有或没有额外的修饰，或在当前正在开发中的其他类型的发酵仪器中进行。实例包 括但不限于气泡柱反应器、两段式生物反应器、滴流床反应器、膜反应器、含有固定化的细 胞的填充床反应器，等。这些装置将用于发展和维持用于建立互养代谢关联的固定C1的同 型产乙酸菌和生产C3的产丙酸菌培养物。此类装置的主要要求包括：
[0052] a.无菌；
[0053] b.厌氧条件；
[0054] c.用于维持温度、压力和pH的适当的条件；
[0055] d.对培养物供给充足的底物量；
[0056] e.进行最优传质以对发酵培养基提供气体
[0057] e.可以从细菌肉汤容易地回收发酵的终产物。
[0058] 发酵反应器可以是，例如，传统的搅拌罐反应器、具有固定化的或悬浮的细胞的柱 发酵罐，连续流动型反应器、高压反应器、具有细胞再循环的悬浮的细胞反应器，和先前列 出的其他实例。此外，可以以含有任何上述反应器的串联和/或并联反应器系统布置反应 器。例如，多个反应器在一组条件下可用于生长细胞并在另一组条件下生成η-丙醇(或其他 产物)并具有最少生长。
[0059] -般而言，将允许共生共培养物的发酵继续进行直到在培养基中生产想要的水平 的丙醇。优选地，生产的丙醇的水平处于2克/升至75克/升的范围并且最优选地处于4克/升 至50克/升的范围。备选地，当达到某生产速度时可以停止生产，例如，当想要的产物的生产 速度已经降低由于，例如，细菌废物积累、底物可用性降低、产物的反馈抑制、活细菌数降 低、或由于本领域技术人员所知的任何其他原因中的任一种。此外，存在连续培养技术，其 允许连续补充新鲜培养基而同时移出使用的培养基，包括其中的任何液体产物（即恒化器 模式）。也可以使用细胞再循环技术以控制细胞密度和因此发酵罐的容积生产率。
[0060] 由本发明的微生物生产的产物可以通过本领域技术人员已知的若干方法中的任 何一种从培养物中移出并纯化。例如，可以通过在大气压或在真空下蒸馏，通过吸收或通过 其他基于膜的分离方法诸如渗透蒸发、蒸气渗透等移出丙醇并进一步加工诸如通过化学/ 催化脱水以生产丙烯。
[0061] 更特别地在以下描述本发明并且本文示出的实施例仅旨在作为说明性的，因为其 中多种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。如本文说明书和其后权利要求书全文 中所用，单数形式"a"，"an"和"the"的意义包括复数参考除非上下文明确指示。说明书中使 用的术语一般而言在本发明的背景中，和在每个术语使用的具体背景中，具有其在本领域 中的普通含义。已经更具体地定义了一些术语以为从业者提供关于本发明的描述的额外的 指导。 实施例
[0062]以下实施例说明本发明的【具体实施方式】，及其多种使用。其仅以解释性的目的示 出，并且不被理解为是限制本发明。
[0063] 实施例1
[0064] C13-标记的丙酸转化为丙醇
[0065] 为了证明在合成气上生长的同型产乙酸菌培养物将丙酸转化为丙醇和其他发酵 副产物，进行c13-丙酸实验。将C 13-丙酸进料给血清瓶中浓度为100mM的同型产乙酸菌培养 物，Clostridium coskatii，并在37°C孵育。在2hr、24hr和1周时从血清瓶收回样品。使用 GC-MC以鉴定含有重稳定同位素 C13的产物。在丙醇峰中发现C13产物并且没有生产不带有C13 标签的丙醇。此外，没有形成含有C13重碳同位素或其质量碎片的其他产物，证明当在合成气 上生长时同型产乙酸菌可以将丙酸还原为丙醇并且没有其他终产物。
[0066] 实施例2
[0067] 同型产乙酸菌发酵罐中丙酸至丙醇
[0068]对生产乙醇的同型产乙酸菌发酵罐连续进料丙酸同时维持发酵肉汤控制在pH为 5.0以研究丙醇的速率和收率。在开始丙酸进料前，发酵罐中乙醇的初始浓度是500mmol/L。 在200mmol/L/hr丙酸的进料速率时，发酵罐中丙醇的浓度达到167mmol/L。发酵罐中的剩余 丙酸是27mmol/L;因此至丙醇的转化效率为97%。发酵罐中乙醇的浓度随着丙醇浓度增加 而稳步降低。在167mmol/L丙醇时发酵罐含有250mmol/L的乙醇。醇的该比例展示了基于发 酵罐中合成气的气体消耗速率的电子平衡。在发酵罐中实现了 〇.22g/L/hr的稳态时丙醇的 生产速率。结果显示了通过在合成气上生长的同型产乙酸微生物的丙酸至丙醇的高转化效 率和速率。此外，这些结果也显示高至l〇g/L(167mmol/L)的丙醇浓度对合成气消耗没有影 响。这些结果表明在与同型产乙酸菌伙伴诸如C.coskatii的共发酵中，丙酸容易地转化为 丙醇并且剩余的乙酸被回收并由此共生共培养物转化为丙醇。
[0069] 实施例3
[0070] 在发酵罐中从乙醇生产丙酸
[0071]以在作为电子源的乙醇和作为碳源的碳酸氢盐和乙醇上生长的Clostridium neopropionicum起始发酵罐。在培养基中进料的乙醇浓度是213mmol/L。在稳态时发酵罐达 到891111]1〇1凡丙酸、51]11]1〇1凡的丙醇、和271]11]1〇1凡的剩余乙醇的浓度。这代表了76%的从乙醇 到丙酸的转化效率，基于1.5摩尔乙醇生产的每摩尔丙酸的理论转化化学计量学。其他反应 产物包括乙酸和少量的丁酸。
[0072] 实施例4
[0073] 通过同型产乙酸菌和使用丙烯酸盐途径的产丙酸菌的共培养物生产丙醇
[0074] 在发酵罐中在合成气上生长并生产乙醇和乙酸盐的C.coskatii的同型产乙酸菌 培养物，与具有乳酸盐丙烯酸盐途径、在乙醇上生长并生产丙酸盐和低水平的丙醇的 C. neopropionicum的厌氧批次(瓶)培养物混合。瓶中的共培养物在合成气下孵育，通过添 加稀释的碳酸氢钠(NaHC0 3)溶液调整pH。共培养物中的初始乙醇浓度为约180mM(8.3g/L)， 其源自合成气发酵。初始丙酸盐浓度为~3mM(0.22g/L)，其引入具有C.neopropionicum培 养基的共培养物混合物中。在初始组成为~38 % C0、~38 %H2、~15 %C02和~9 % CH4的合成 气氛围下培养共培养物。周期性地调节pH以保持pH 6.0或高于pH 6.0的水平。在48h后，取 得并分析样品。分析显示乙醇被消耗并且丙醇生产峰在36mM(2.2g/L)，是初始摩尔丙酸盐 浓度12倍的水平，表明丙醇源自合成气生产的乙醇并且不仅仅是初始存在的丙酸盐的转化 的产物。在孵育的第三天时（当实验结束时)在这些条件下丙酸盐浓度也增加至33mM(2.4g/ L)。这些结果提示生溶剂的代谢合成气的同型产乙酸菌和代谢乙醇的生产丙酸盐的厌氧细 菌的共培养物可以以显著的收率从源自合成气的乙醇生产丙醇。
[0075] 实施例5
[0076] 通过同型产乙酸菌和使用甲基丙二酰-琥珀酸途径的产丙酸菌的共培养物生产丙 藍
[0077]在发酵罐中在合成气上生长并生产乙醇的C.coskatii的同型产乙酸菌培养物，与 使用甲基丙二酸-琥珀酸途径、在乙醇上生长并生产丙酸盐和低水平的丙醇的丙酸暗杆菌 的厌氧批次(瓶)培养物混合。共培养物中的初始乙醇浓度为约120mM(5.6g/L)，其大部分源 自合成气发酵。初始丙酸盐浓度为~1.8mM，其引入具有丙酸暗杆菌培养基的共培养物混合 物中。在初始组成为约38%C0、38%H 2、15%C02和9%CH4的合成气氛围下在30°C在瓶中孵育 共培养物并搅拌。通过添加稀释的碳酸氢钠(NaHC0 3)溶液调整共培养物混合物的初始pH至 ~7.0。在8天孵育时间末时取得的用于分析的样品显示乙醇利用和丙醇生产。约40%的原 来存在于混合物中的乙醇被消耗(47.44mM)，这导致最终总C3化合物(丙醇+丙酸盐)浓度为 17.5mM。丙醇代表了大多数C3生产，终浓度为14.43mM而丙酸盐浓度为3.07mM。这些浓度分 别代表丙醇和丙酸盐初始值的13倍和1.67倍增加，和14.56mM C3化合物的净生产。在其中 不存在丙酸暗杆菌细胞的对照实验中没有净C3化合物生产。这些结果表明生溶剂的代谢合 成气的同型产乙酸菌和代谢乙醇的生产丙酸盐的厌氧细菌的共培养物可以以显著的收率 从源自合成气的乙醇生产丙醇。
【主权项】
1. 生产丙醇的方法，所述方法包括在共生共培养物有效将气体底物转化为丙醇和/或 丙酸的条件下将选自由一氧化碳、二氧化碳和氢气或其组合组成的组的气体底物暴露给包 含固定Cl的微生物和生产C3的微生物的共生共培养物。2. 权利要求1的方法，其中固定Cl的微生物是使用乙酰-CoA途径的生溶剂产乙酸菌。3. 权利要求1的方法，其中固定Cl的微生物选自由Clostridium Coskatii、扬氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)、Clostridium authoethanogenium、Clostridium ragsdalei、Alkalibaculum bacchi、Clostridium thermoaceticum、和乙酉爱梭菌 (Clostridium aceticum)组成的组。4. 权利要求1的方法，其中生产C3的微生物是产丙酸菌。5. 权利要求4的方法，其中产丙酸菌使用乳酸盐-丙烯酸盐途径用于生产丙酸盐。6. 权利要求4的方法，其中产丙酸菌使用甲基丙二酰-琥珀酸途径用于生产丙酸盐。 7 ·权利要求1的方法，其中生产C3的微生物选自由Clostridium neopropionicum、丙酸 梭菌(Cl ostri dium propioni cum)、丙酸暗杆菌(Pe lobac ter prop ion i cus )、丙酸脱硫叶菌 (Desulfobulbus propionicus)、沃氏共养杆菌(Syntrophobacter wolinii)、普氏共养杆 菌（Syntrophobacter pfennigii)、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducensNSmithella propionica、DesulfotomacuIum thermobenzoicum subspecies thermosyntrophicum、Pelotomaculum thermopropionicum、和Pelotomaculum schinkii组成的组。8. 权利要求1的方法，其中气体底物是合成气。9. 权利要求1的方法，其中共生共培养物的pH维持在约5.0至7.0之间。10. 用于将合成气转化为丙醇和/或丙酸的厌氧共生系统，所述系统包含合成气、培养 基、固定Cl的微生物和生产C3的微生物。11. 权利要求10的厌氧共生系统，其中固定Cl的微生物是使用乙酰-CoA途径的生溶剂 产乙酸菌。12. 权利要求10的厌氧共生系统，其中固定Cl的微生物选自由Clostridium Coskatii、 扬氏梭菌、Clostridium authoethanogenium、和Clostridium ragsdalei和Alkalibaculum bacchi、Clostridium thermoaceticum、和乙酸梭菌组成的组。13. 权利要求10的厌氧共生系统，其中生产C3的微生物是产丙酸菌。14. 权利要求10的厌氧共生系统，其中生产C3的微生物选自由Clostr idium neopropionicum、丙酸暗杆菌和丙酸脱硫叶菌、沃氏共养杆菌、普氏共养杆菌、 Syntrophobacter fumaroxidansnSyntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionicaNDesulfotomaculum thermobenzoicum subspecies thermosyntrophicum、 Pelotomaculum thermopropionicum、和Pelotomaculum schinkii组成的组。15. 权利要求13的厌氧共生系统，其中产丙酸菌使用乳酸盐-丙烯酸盐途径用于生产丙 酸盐。16. 权利要求13的厌氧共生系统，其中产丙酸菌使用甲基丙二酰-琥珀酸途径用于生产 丙酸盐。17. 权利要求10的厌氧共生系统，其中培养基的pH维持在约5.0至约7.0之间。
【文档编号】C12P7/04GK105899669SQ201480014261
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年3月14日
【发明人】R·达塔, M·恩齐安, R·希基, W·莱文森
【申请人】赛纳塔生物有限公司