糖修饰的核酸分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用缀合物转染细胞，该缀合物包含至少一个糖残基和至少一个选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分。该缀合物适于以高效率转染原核和真核细胞，例如植物细胞或包括人细胞在内的哺乳动物细胞。因此,为治疗分子提供了新的递送载体，所述治疗分子包括反义分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或这样的分子的前体以及所述的治疗性的核苷或核苷酸。进一步提供了用于发展展示特定性状的新的植物品系的方便的策略。
【专利说明】糖修饰的核酸分子
[0001] 本发明涉及使用包含至少一个糖残基和至少一种选自核酸、核苷和核苷酸的核苷 组分的缀合物转染细胞。该缀合物适用于高效转染原核和真核细胞，例如植物细胞或哺乳 动物细胞，包括人细胞。因此，为治疗分子提供了新的递送载体，所述治疗分子包括转录物、 信使RNA、反义分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或这样的分子的前体以及所述的治 疗性的核苷或核苷酸。进一步提供了用于发展展示特殊的性状的新的植物品系的方便的策 略。
[0002] RNA干扰是强有力的工具，其利用短的RNA双链来抑制特定的蛋白质在细胞中的形 成（1-3)。本质上，所述的沉默RNA分子是通过切酶复合体切割，由较大的转录物产生的(4)。 然而对于生物技术应用，所述的RNA分子（siRNA)是以化学方法制备和施用的。在最近的十 年，使用siRNA作为治疗剂的思想（5)受到强烈地追求，但是所述的主要障碍:RNA双链体的 差的细胞摄取不能被克服(6)。目前，不同的RNA递送系统例如纳米颗粒(7,8)、脂质体(9， 10)或聚阳离子聚合物（11)处于密集的研究之下。尽管在所述领域有实质性进展，然而，所 述的经常还很高的毒性(12-14)和低的细胞的特异性代表了还没有被解决的问题。
[0003] 最近，受体介导的细胞内吞作用已经逐渐成为备选的递送策略（16-25)，其允许把 所述的siRNA靶向特殊细胞类型。所述的方法要求把所述的siRNA连接到与细胞类型特异性 的受体结合的配体。这引发内化作用加工，导致RNA-配体缀合物的摄取。目前，采用胆固醇 修饰的RNA最成功地实施了所述的策略(24)。
[0004] PCT/EP2013/064610(通过引文把它的公开内容并入本文中）描述了缀合物，其中 使多不饱和脂肪酸残基(例如花生四烯酸残基)与核苷组分共价结合。这些缀合物特别地可 用于与其中存在大麻素受体的细胞接触。特别是，可以使用该缀合物转染神经元细胞和免 疫细胞。然而，仍然需要转染敏感细胞以及特别到目前为止难以转染的那些细胞的方便的 策略。
[0005] 在本发明中发现，采用糖修饰的寡核苷酸可以使存在于原核和真核细胞两者的细 胞膜中的糖转运蛋白被有效地靶向。相应的受体介导的策略可以被成功地用于转染多种敏 感细胞。
[0006] 本发明的第一个方面是包含糖残基和至少一种核苷组分的缀合物在转染细胞中 的用途。
[0007] 术语"缀合物"也包括盐，特别是药学上可接受的盐，例如与无机的或有机的酸或 碱的加成盐，正如本领域公知的那样。.
[0008] 根据本发明优选的方面，所述的缀合物包含糖残基和与其共价结合的至少一种核 苷组分。根据另一个方面，根据本发明使用的缀合物可以包含至少一种核苷组分和与其非 共价结合的糖修饰的化合物。术语"糖修饰的化合物"是指包含至少一个糖残基并且能够与 核苷组分非共价结合(例如经由静电相互作用）的任何化合物。糖修饰的化合物的实例是聚 阳离子物质，例如包含至少一个糖残基的阳离子型聚合物或阳离子型脂质体，其可以与聚 阴离子核酸分子形成离子型缀合物。所述的糖残基可以与所述的化合物共价或非共价连 接。
[0009] 用于本发明中的缀合物包含至少一个糖残基，特别地1-10个，更特别地1-5个糖残 基。甚至更特别地，所述的缀合物包含1或2个糖残基。最特别地，所述的缀合物包含1个糖残 基。如果所述的缀合物包含超过一个糖残基，则所述的糖残基可能是相同的或不同的。
[0010] 与所述的糖残基相连的所述的核苷组分可以选自核酸、核苷和核苷酸。
[0011] 在更具体的实施方式中，与所述的糖残基相连的所述的核苷组分是核酸分子，更 特别地是RNA分子。
[0012] 所述的缀合物包含至少一个核苷组分，特别地包含1-25,更特别地包含2-20或2-10，并且甚至更特别地包含2-8，即2、3、4、5、6、7或8个核苷组分。如果所述的缀合物包含超 过一个核苷组分，则所述的核苷组分可以是相同的或不同的。
[0013] 在一种实施方式中，所述的缀合物可以包含：
[0014] (i) -个糖残基和一个核苷组分，例如一个核酸分子，
[0015] (i i)多个糖基和一个核苷组分，例如一个核酸分子，
[0016] (i i i) -个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子，或
[0017] (iv)多个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子。
[0018] 在更具体的实施方式中，所述的缀合物包含1个糖残基和2-20,特别是2-8,即2、3、 4、5、6、7或8个核苷组分。
[0019] 在一种实施方式中，所述的缀合物可以具有线型结构。因此，核苷组分可以被连接 成直链，其中糖残基可以存在于所述的链之内、在所述的链的一端或在所述的链的两端。
[0020] 在另一种实施方式中，所述的缀合物具有分支结构，其中核苷组分经由分枝的接 头(例如树枝状的接头)与糖残基结合。
[0021 ]术语"糖残基"包括单糖、二糖和寡糖。单糖残基的实例是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、 核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖和唾液酸。二糖包括例如蔗糖、乳糖、海藻糖和麦芽糖。按照本 发明，能被作为糖残基使用的寡糖包括线性的、分枝的或环状的寡糖。所述的寡糖典型地包 含小数目（三至九）的单糖单元。环状的寡糖的特别优选的实例是环糊精。
[0022]可以使所述的糖残基与至少一种核苷组分共价结合。优选地，使所述的糖残基经 由接头与所述的至少一种核苷组分结合。所述的接头可以是线性的或分枝的接头并且通常 具有2-50个原子的链长，包括碳原子以及特别是杂原子(例如S、N和/或0-原子)在内。
[0023]例如，所述的接头可以是线性的接头，例如包含至少一个(例如1 -10个，特别地2-5 个以及更特别地3个)C1-C3稀化氧基团(特别地氧化乙烯基团）的接头。
[0024]备选地，所述的接头可以是分枝的，例如树枝状的接头。
[0025]可以经由已知的接头技术，把所述的糖残基连接到所述的至少一种核苷组分。然 而优选地，所述的连接涉及Click反应，例如在叠氮化物和炔基团之间、在受限的链烯(例如 降冰片烯)和腈亚胺、腈氧化物或四嗪之间，从而导致由所述的Click反应形成的环状基团， 特别地1，2,3_三唑基团。
[0026]在一种具体的实施方式，根据本发明使用的所述的缀合物由通式（la)或（lb)表 示：
[0027 ] Fn一(Lm_N)r (la)
[0028] Fn-(Lm_N)r-Lm_Fn ( lb)
[0029] 其中F是糖残基，
[0030] L是接头，
[0031 ] N是核苷组分，其选自核酸、核苷和核苷酸，
[0032] η是1-10,优选地1-5,更优选地为1的整数，，
[0033] m是 0或 1，
[0034] r是1 -25，优选地2-20以及更优选地2-8的整数。
[0035] 在这个实施方式中，所述的缀合物可以由结构例如下列的结构代表：
[0036] F-L-N [0037 ] F一(L一N)r
[0038] 其中F、L、N和r如上文定义，
[0039] F-L*-(N)r
[0040] 其中L*是分枝的接头，并且F、N和r如上文定义，
[0041] F-(L-N)r-L-F
[0042] 其中F、L、N和r如上文定义。
[0043] 在另一种实施方式中，所述的缀合物可以包含与所述的至少一种核苷组分共价结 合的另一受体配体。所述的另一受体配体是不同于糖残基的化合物，例如叶酸、胆固醇、激 素或多不饱和脂肪酸残基，特别是花生四烯酸残基，例如花生四烯酸乙醇胺。
[0044] 在这个实施方式，所述的缀合物可以由具有所述的通式(II)的结构代表：
[0045] Fn一(Lm一N)r一Lm一Zs (II)
[0046] 其中
[0047] F是糖残基，
[0048] L是接头，
[0049 ] η是1 -10，优选地1 -5，更加优选地为1的整数，
[0050] m是 0或，
[0051 ] N是核苷组分，其选自核酸、核苷和核苷酸，
[0052] r是1 -25，优选地2-20以及更优选地2-8的整数，
[0053] Z是另一受体配体，并且
[0054] s是1 -10，优选地1 -5，更加优选地为1的整数。
[0055] 在这个实施方式中，所述的缀合物可以由结构例如下列的结构代表：
[0056] F-L-N-Z
[0057] F-(L-N)r-L-Z
[0058] 其中F、L、N、Z和r如上文定义，
[0059] F-L*-(N)r-L-Z
[0060] L*是分枝的接头，并且F、L、N、Z和r如上文定义。
[0061] 用于本发明中的所述的缀合物包含至少一种选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组 分。
[0062] 术语"核酸"包括单链的和双链的核酸分子，例如DNA分子或RNA分子以及其类似 物。核酸的类似物是包含至少一个如下所述的修饰的结构单元的核酸分子。
[0063]在一种实施方式中，所述的核酸分子是可以包含至少一个修饰的结构单元的DNA 分子。术语"DNA分子"包括单链或双链DNA分子。在双链DNA分子中，所述的单条链可以以分 开的分子存在或经由单链环或经由异质的接头被共价连接。
[0064] 术语"DNA分子"包括由天然的DNA结构单元（即2'-脱氧核糖核苷酸结构单元)组成 的分子以及包含至少一个修饰的结构单元的分子。
[0065] 在进一步的实施方式中，所述的核酸分子是RNA分子，其可以包含至少一个修饰的 结构单元。术语"RNA分子"包括单链或双链RNA分子，其中双链RNA分子可以具有至少一个突 出端，例如至少一个3'-突出端。在双链RNA分子中，所述的单条链可以以分开的分子形式存 在或经由单链环或经由异质的接头被共价连接。
[0066] 术语"RNA分子"包括由天然的RNA结构单元（即2'-核糖核苷酸结构单元)组成的分 子以及包含至少一个修饰的结构单元的分子。
[0067] 修饰的结构单元可以选自糖_、主链-和/或核碱基-修饰的结构单元。糖-修饰的脱 氧核糖核苷酸包含不同于脱氧核糖的糖基团，例如修饰的脱氧核糖基团，其中所述的2'_氢 基团被选自下列的基团替代:〇!1、1?、(《、卤素、3!1、31?、順 2、順1?、冊2或〇1其中1?是(：1-(：6烷基或 烷氧基或(： 2-〇5烯基或炔基，并且卤素是？、(：1』^1。2'-!1修饰的具体实例是2'4和2'-0甲 基。糖-修饰的核糖核苷酸包含不同于核糖的糖基团，例如修饰的核糖基团，其中所述的2'-OH基团被选自下列的基团替代:!1、1?、01?、卤素、3!1、31?、順 2、腦?、冊2或〇1其中1?是(：1-(：6烷基 或烷氧基或C 2_C6烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br、I。2 ' -OH修饰的具体实例是2 ' -F和2 ' -0 甲基。在主链-修饰的结构单元中，所述的连接相邻结构单元的磷酸酯基团可以被修饰的连 接基团（例如硫代磷酸酯基团）替代。在核碱基-修饰的结构单元中，可以存在非天然发生的 核碱基代替天然发生的核碱基。嘌呤或嘧啶核碱基的相应的类似物是本领域熟知的。应该 注意到以上所述修饰可以组合。
[0068] 所述的核酸分子优选地选自适于药物应用的核酸分子，特别地选自反义分子或能 够介导RNA干扰的RNA分子，例如s i RNA分子或其前体。更多的合适的RNA分子包括mi RNA分 子、antagomirs、核酶以及其前体。也优选RNA-转录物，例如特别是mRNA。
[0069] 术语"核苷组分"也包括核苷或核苷酸以及其类似物。核苷是包含核碱基和糖基团 的化合物。核苷酸化合物是包含核碱基、糖基团和磷酸酯基的化合物。本发明也包括糖_、磷 酸酯-和核碱基-修饰的化合物，特别是适于治疗癌症和/或病毒感染的核苷或核苷酸类似 物治疗剂，例如AZT、阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、吉西他滨、阿糖胞苷等等。
[0070] 可以经由所述的分子的核碱基、糖或磷酸基，使所述的核苷组分与所述的糖残基 相连。如果所述的化合物是核酸，可以经由存在于所述的核酸分子中的结构单元，特别地经 由末端结构单元，即位于核酸链的5'_或3'-端的结构单元，使所述的核苷组分连接。在优选 的实施方案中，所述的连接经由存在于核酸分子(特别是RNA分子）中的修饰的末端核碱基 发生。根据特别优选的实施方案，所述的糖残基与所述的RNA转录物（例如特别是mRNA)的 5或3末端结构单元共价结合。这些缀合物被证明是尤其适于转染植物细胞并且赋予目 的植物任何期望的性状。
[0071] 在优选的实施方案中，所述的与所述的糖残基的共价连接可以被连接到存在于所 述的核苷组分中的核碱基，例如DNA或RNA分子的结构单元的核碱基，例如连接到嘌呤碱基 的位置8或嘧啶碱基的位置5。
[0072] 核酸分子，例如DNA或RNA分子通常具有从5、10、12、15或18个结构单元到多达25、 30、50或100个结构单元或更多的长度。可以通过化学合成或通过酶促法，从核酸模板(例如 通过转录、通过RNA聚合酶催化的（例如通过T3、T7或SP6RNA聚合酶），或通过DNA复制或通过 反转录)制备所述的核酸分子。优选地，在化学合成或酶催化合成期间掺入结构单元，其包 含官能团，例如Click官能团，例如末端炔基团或置氣基、受限的稀经基团（例如降冰片烯基 团）、腈氧化物基团、腈亚胺基团或四嗪基团。在具体的实施方式中，掺入了通过包括末端炔 基团（任选地经由接头)而被修饰的结构单元。把Cl i ck修饰的结构单元引入核酸分子中的 方法被描述在W02006/117161和W02008/052775中，通过引文把它们的内容掺入本文中。可 以按照已知的方法，使所述的核苷组分上的所述官能团和与所述的多不饱和脂肪酸残基相 连的互补的官能团偶联。优选地，通过例如Click反应，采用互补的Click功能性反应基(例 如叠氮基)进行所述的偶联。
[0073] 备选地，可以在固相合成期间，按照标准方法，例如使用亚磷酰胺结构单元，把与 所述的糖残基相连的修饰的核酸结构单元引入核酸(例如RNA)分子中。
[0074] 可以从具有通式(V)的试剂制备根据本发明使用的缀合物：
[0075] Fn-(L，）m_(RGl)r (V)
[0076] 其中F、n、m和r如上文定义，
[0077] L'是接头，并且
[0078] RG1是反应基，特别是Click-反应基，例如叠氮基(或炔基团）。
[0079] 用于生产根据本发明使用的核酸缀合物的另一试剂由通式(VI)表示：
[0080] BB-(L)m-Fn (VI)
[0081 ] 其中F、L、n和m如上文定义，并且
[0082] BB是用于合成核酸分子的结构单元，例如三磷酸核苷，或适于固相合成的结构单 元，例如亚磷酰胺。
[0083]本发明的进一个的方面是生产缀合物的方法，其中使糖残基与RNA转录物（例如 mRNA)的3 ' -或5 ' -端共价结合，所说的方法包括：
[0084] (i)使所述的试剂(V)与至少一种修饰的核苷组分(VII)偶联
[0085] (N'）r-(L"）m_RG2 (VII)
[0086] 其中Ν'是RNA分子，例如mRNA分子，
[0087] L"是接头，
[0088] r和m如上文定义，
[0089] RG2是能够与RG1起反应的反应基，特别是Click反应基，例如炔基团（或叠氮基）， 从而形成所述的缀合物，或
[0090] (i i)使所述的试剂(V)与至少一种修饰的核酸结构单元(VIII)偶联
[0091] BB-(Dm-RG2 (VIII)
[0092] 其中BB是用于合成RNA分子的结构单元，
[0093] L"是接头，
[0094] m是0或1，并且
[0095] RG2如上文定义，
[0096] 从而形成所述的试剂(VI)，并且把所述的试剂(VI)掺入RNA分子中，例如通过化学 合成或酶促合成，从而形成所述的缀合物。
[0097] 本发明的进一步的方面涉及在细胞或有机体中介导靶特异性的核酸修饰的方法， 其包括下列所述的步骤：
[0098] (a)使细胞或有机体与本发明所述的缀合物在其中可以发生靶特异性的核酸修饰 的条件下接触，并且
[0099] (b)介导靶特异性的核酸修饰，它是通过所述的缀合物的所述的核苷组分朝向靶 核酸进行的。
[0100] 接触步骤(a)可以包括把所述的缀合物引入靶细胞(例如分离的靶细胞）中，该细 胞可以存在于细胞培养物、单细胞的微生物或靶细胞或在多细胞生物之内的许多靶细胞 中。所述的祀细胞优选地是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，包括人细胞或植物细胞。所述 的靶有机体优选地是植物或哺乳动物有机体，例如人有机体。所述的引入到有机体可以包 括肠胃外施用，例如通过注射或输注、跨粘膜施用或透皮施用。在转染植物细胞情况下，意 外地发现:如果所述的缀合物被添加到所述的植物的根上，包含糖残基以及与其共价结合 的核苷组分的所述的缀合物被植物摄取。因此，把缀合物引入植物中可以包括向所述的根 施用所述的缀合物。
[0101] 介导步骤(b)优选地包括抑制靶核酸，例如当使用s iRNA缀合物时，通过RNA干扰， 或者当使用反义分子缀合物时，通过抑制mRNA转录，或者通过使用治疗性的核苷/核苷酸缀 合物来抑制病毒或肿瘤细胞的复制。
[0102] 优选地通过受体介导的胞吞作用，更优选地通过糖转运蛋白介导的细胞内吞作 用，向靶细胞中引入所述的缀合物。因此，可以在缺乏递送载体和/或转染试剂的情况下，把 所述的缀合物引入所述的靶中。
[0103] 在一种实施方式中，所述的缀合物被用于在体外转染细胞，特别是用于转染植物 细胞或哺乳动物细胞，包含在体外转染人细胞。
[0104] 在另一种优选的实施方案中，所述的缀合物被用于在体外或者在体内转染植物细 胞。
[0105] 已经令人惊奇地发现:本发明所述的缀合物特别适于转染表达糖转运蛋白缀合物 的植物细胞。可以成功地把缀合物引入植物细胞中，所述缀合物中糖残基与单链或双链RNA 分子(例如mRNA或反义RNA)的5 或3 端共价结合。
[0106] 进一步，其中在上文中描述的，糖修饰的化合物与单链或双链RNA分子非共价结合 的缀合物已经显示特别适于转染植物细胞。例如，可以使用包含单链或双链RNA分子和糖修 饰的化合物的非共价的缀合物，优选离子型缀合物。
[0107] 在进一步的实施方式中，本发明所述的缀合物用于医学，特别是人医学，但是也用 于兽医学。因此，本发明也提供包含如上所述缀合物作为活性成分以及合适的载体的药物 组合物。为了诊断性的或治疗性的应用，所述的药物组合物可以呈溶液的形式，例如用于输 注或注射的溶液、乳膏、油膏、片剂、混悬剂等等。可以以任何合适的方式，例如通过肠胃外 施用，例如注射或输注，通过跨粘膜应用，或通过透皮应用，或通过口服、局部、鼻、直肠用药 等等，来施用所述的组合物。
[0108] 所述的药物组合物可以包含非微囊剂型(例如无递送载体，例如脂质体和/或无转 染试剂)的所述的缀合物作为活化剂。
[0109] 所述的缀合物可以被用来在细胞或有机体中下调基因，例如病毒的基因或与细胞 的疾病相关联的基因，例如致癌基因，或与自身免疫或变态反应病相关联的基因。优选的细 胞靶基因是例如所述的syk基因，它是编码脾酪氨酸激酶(SYK)的与自身免疫或变态反应病 相关联的基因，它参与IgE依赖性的炎性信号传导级联。所述的人SYK直向同源物被描述在 UniProt P 43405中，所述的鼠 SYK直向同源物被描述在UniProt P 48025中。进一步优选的 靶基因是所述的APP基因，其编码所述的淀粉状蛋白前体蛋白（APP)。所述的人APP直向同源 物被描述在UniProt P 05067中。APP被β-或γ分泌酶切割成与阿尔茨海默氏病的发展相关 联的神经毒性的片段。优选病毒靶基因是编码所述的单负病毒目的病毒例如埃博拉病毒、 麻疹病毒和狂犬病病毒的所述Ν或Ρ蛋白质的基因。
[0110] 本发明的进一步的方面是转染细胞(优选地植物细胞)的方法，包括使细胞暴露于 如在上文中描述的缀合物。所述的使植物细胞暴露于在本文中定义的缀合物的步骤优选地 包括把所述的缀合物添加到植物的根部。能够观察到所述的缀合物然后被所述的植物摄取 并且被所述的根转运。特别是，使用本发明所述的方法，可以成功地把其中糖残基与单链或 双链RNA分子(例如mRNA或反义RNA)的所述的3 ' -或5 ' -端共价结合的缀合物引入植物细胞 中。
[0111] 进一步，在上文中描述的其中糖修饰的化合物与单链或双链RNA分子非共价结合 的缀合物已经显示特别适于转染植物细胞。例如，可以使用单链或双链RNA分子和糖修饰的 化合物的非共价的（例如离子型)缀合物。因此本发明提供用于发展展示特定的性状的新的 植物系的方便的策略。
[0112] 将会通过下列附图和实施例更详细地描绘本发明。
【附图说明】
[0113] 图 1
[0114]糖修饰的siRNA的化学结构和序列。作为比较实施例，显示了花生四烯酸乙醇胺修 饰的siRNA。
[0115] 图2
[0116] 葡萄糖修饰的siRNA向植物细胞的递送。添加到拟南芥的根上的葡萄糖修饰的 siRNA被所述的植物摄取并且被沿着所述的根转运（AleXa = AleXaFlu〇r?647，Life Technologies)〇
[0117] 图3
[0118] 糖修饰的试剂的合成。所述的反应方案显示葡萄糖叠氮化物(Α)和三葡萄糖叠氮 化物的制备。
[0119] 图4
[0120] 通过铜（I)-催化的叠氮化物-炔环加成作用(CuAAC)合成葡萄糖修饰的siRNA。
[0121] 图5
[0122] 在采用针对海肾萤光素酶的葡萄糖修饰的siRNA双链体处理后，与具有花生四烯 酸乙醇胺修饰的相同的siRNA(AEA-siRA)相比，在RBL-2H3细胞中海肾萤光素酶的相对表 达。在具有11. ImM葡萄糖的培养基中（黑色)或在无葡萄糖的培养基中（绿色)培养所述的细 胞。
[0123] 图6
[0124] 使用T7RNA聚合酶和γ -葡萄糖标记的GTP的体外转录标记实验的原理。
[0125] 图7
[0126] 使用T4RNA连接酶的RNA的区域选择性的化学-酶促标记。 实施例
[0127] 1.RNA-糖缀合物的合成
[0128] 如在图4中描述的那样，进行所述的糖修饰的RNA链的合成。所述的合成的中心要 素是所述的在炔修饰的RNA链和所述相应的葡萄糖叠氮化物1之间的Cu-催化的炔-叠氮化 物click反应(34-39)。为了比较葡萄糖修饰的RNA与其他系统，click方法也用于制备使用 三葡萄糖单叠氮化物2制备三葡萄糖-RNA缀合物以及采用所述的β-环糊精单叠氮化物3制 备β-环糊精修饰的RNA链。进一步，作为比较实施例，通过使用花生四稀酸乙醇胺单叠氮化 物(ΑΕΑ)4,制备了花生四烯酸乙醇胺修饰的RNA链。各自的糖残基以及花生四烯酸乙醇胺单 叠氮化物被显示在图1中。在所有的情形中，在所述的RNA链和所述的各自的配体之间引入 短的乙二醇间隔区。在所有的情形中，在RNA链和各自的配体之间引入短的乙二醇间隔基。 所述的Click技术确保所述的糖或花生四烯酸乙醇胺分子与RNA的有效连接。另外，所述的 方法确保在更难以靠近所述的siRNA双链体的3 ' -端处有效率的缀合。3 ' -修饰的siRNA链典 型地被所述的RNAi机器(41)更好地容忍。为了实现所述的3'-端连接，在RNA合成期间使用 了在C5具有辛二英(octadiine)柄的脱氧尿苷亚磷酰胺。
[0129] 所述的葡萄糖叠氮化物和三葡萄糖叠氮化物的合成被显示在图3中。在第一步中， 为了制备所述的葡萄糖叠氮化物1，使用2'-溴乙醇把乙二醇间隔区引入被保护的葡萄糖衍 生物中。在随后的步骤中，在将所述的葡萄糖衍生物去保护而得到葡萄糖叠氮化物1以前， 引入叠氮化物官能度。为了合成所述的三葡萄糖叠氮化物，首先从季戊四醇和炔丙基溴制 备分枝的接头。随后，在保护所述的剩余醇官能度之后，把三份葡萄糖叠氮化物添加到 Click反应在中。将所述的醇官能度去保护并且引入另一种叠氮化物官能度，最后得到所述 的三葡萄糖叠氮化物2。
[0130] 随后使所述的叠氮化物以优良的产率发生click反应而得到包含炔的RNA有义链， 如图4中所示。在HPLC提纯之后，使所述的糖修饰的RNA与所述的反义反链杂交而获得在图1 中描述的siRNA双链体。
[0131] 2. RNA-糖缀合物向细胞中的递送
[0132] 为了显现所述的RNA双链体向活细胞中的递送，最初使所述的糖修饰的RNA有义链 与包含焚光素标记(Alexa=Alexa_JTl||.O.r?647，Life Technologies)的反义链杂交。
[0133] 采用拟南芥细胞研究了所述的葡萄糖修饰的RNA双链体的摄取。把葡萄糖修饰的 siRNA添加到拟南芥的根上。在图2中描述的共焦显微术研究显示未修饰的siRNA像期望的 那样不能进入所述的细胞。然而，在各自的细胞内容易检测到葡萄糖修饰的siRNA，这证明 了摄取和沿着所述的根的转运。用修饰的dsDNA也观察到相同的结果(没有显示）。
[0134] 为了证明所述的递送的siRNA分子展示所期望的RNAi效果，使用市场上可获得的 双萤光素酶报道基因测定法。把包含两种萤光素酶(海肾和萤火虫）的质粒转染到所述的细 胞中。通过靶向所述的海肾萤光素酶的表达评价了 RNAi，而所述的荧光虫萤光素酶充当内 标。为了这些研究，使用了无进一步荧光素修饰的葡萄糖修饰的siRNA。采用未修饰的RNAI 链体(没有葡萄糖，没有荧光素）的起始控制实验显示所述的海肾表达不受影响。相比之下， 在两种细胞系中都观察到在配体修饰的SiRNA存在时海肾表达的剂量依赖性沉默(图5)。最 主要的，即使相对低数量的siRNA-配体缀合物也已经显示相当大的效果。
[0135] 其次评价了与所述的花生四烯酸乙醇胺-siRNA缀合物相比，所述的葡萄糖修饰的 siRNA的沉默效力。这个比较的结果被描述在图5中。令人惊奇地，所述的新的葡萄糖修饰的 siRNA总是比所述的花生四烯酸乙醇胺体系显著更有效，其确立葡萄糖和其它糖残基作为 强大的新的递送工具。
[0136] 3.使用γ -标记的核苷酸的5 ' -RNA标记
[0137] 为了在所述的5'-端标记RNA-转录物，首先在39聚体处制备了带有所述的Τ7启动 子序列的DNA模板，随后制备了短的编码的转录物。这允许不依赖引物的RNA聚合反应，其产 生21聚体RNA转录物。由于所述的聚合酶的从头初始化，所述的第一次使用的RNA核苷酸在 所述的转录物中仍然充当三磷酸酯，提供了独特的5'-糖标记的转录产物。因为所述的 T7RNA聚合酶通常开始于CCn-序列，其产生G-启动转录物，采用葡萄糖-标记的GTP进行所述 的实验。尽管存在所述的葡萄糖残基，但是所述的T7-RNA聚合酶接受所述的标记的三磷酸 酯并且继续所述的转录加工，以提供所述的期望的葡萄糖标记的产物。
[0138] 下列编码T7启动子序列和21聚体转录物的编码和模板链是从Me tabion购买的。
[0139] 编码：5 ' -dATAATACGACTCACTATAGGC
[0140] 模板：3，-dTATTATGCTGAGTGATATCCGGAAAGTGATGAGGATGGA-5 '
[0141 ] 在转录之前，在热循环仪(来自Eppendorf的Mastercycler Personal)中把所述的 链退火。因此，在缓冲液（100mm NaCl，25mm Tris-HCl，pH=7.6,在25°C)中，施加下列温度 梯度:95°C持续4分钟，随后以2°C/分钟冷却到4°C，把20μπι的编码链与20μπι的模板链退火。
[0142] 在0.2mL PCR管中以20yL设置进行体外转录。在转录缓冲液（40mM HEPES ρΗ = 7.4,6mM MgCl2,2mM，10mM DTT)中，向 40pmol 的所述的杂交的 DNA 模板中添加 400μΜ ATP、 CTP、UTP、20-80yM GTP(对于所述的对照，400μΜ)和400μΜ葡萄糖标记的GTP 7d。通过添加一 个单位T7RNA聚合酶(New England Bio labs)启动所述的反应，小心地混合，然后在37 °C温 育。在5个小时之后，通过添加一个体积RNA负荷染料(47.5 %甲酰胺，0.01 % SDS，0.01 %溴 酚蓝，0.005%二甲苯蓝，0.5mM EDTA)停止所述的转录，并且在20%变性聚丙烯酰胺凝胶 (7M尿素，3511^，1000￥)上分析2(^1^的每个样品，并且使用1^3-3000成像系统（1^7七68〇显 现。为了显现RNA转录物，施加 SYBR绿II染色。
[0143] 4 ·使用T4RNA连接酶的3 ' -RNA标记
[0144] 在ATP的存在下，T4RNA连接酶催化胞嘧啶核苷3 '，5 ' -二磷酸向单链RNA的3 ' -OH的 转移。
[0145]因此，可以使单链RNA分子在T4RNA连接酶和ATP存在下与在磷酸基处携带炔部分 的标记的胞嘧啶核苷3'，5'_二磷酸反应。随后与叠氮化物修饰的糖残基的click反应(正如 在图1中显示的那样)允许制备3'-修饰的单链RNA分子，如图7中显示的那样。
[0146] 参考文献
[0147] (1)Fire,A.Z.Angew.Chem.Int. Ed.2007,46,6966-6984.
[0148] (2)Elbashir,S.M.；Harborth,J.；Lendeckel,ff.；Yalcin,A.；ffeber,K.；Tuschl, T.Nature 2001,411,494-498.
[0149] (3)Me1lo,C.C.Angew.Chem.Int. Ed.2007,46,6985-6994.
[0150] (4)Bernstein，E.;Caudy，A.A.;Hammond，S.M.;Hannon，G.J.Nature 2001，409， 363-366.
[0151] (5)Castanotto,D.；Rossi,J.J.Nature 2009,457,426-433.
[0152] (6)Tiemann,K.；RossiJ.J.EMBO Mol.Med.2009,1,142-151.
[0153] (7 )Davis ,M. E . ； Zuckerman , J. E . ；Choi,C.H.J. ；Seligson,D. ；Tolcher,A.； Alabi,C.A.；Yen,Y.；HeidelJ.D.；Ribas,A.Nature 2010,464,1067-1070.
[0154] (8)Baigude，H. ;McCarro11，J. ;Yang，C.S. ;Swain，P·M· ;Rana，T·M·ACS Chem.Biol.2007,2,237-241.
[0155] (9)Zimmermann，T·S·;Lee，A·C·H·;Akinc，A·;Bramlage，B·;Bumcrot，D·; Fedoruk,M.N.；Harborth,J.；Heyes,J.A.；Jeffs,L.B.；John,M.；Judge,A.D.；Lam,K.； McClintock,K.；Nechev,L.V.；Palmer,L.R.；Racie,T.； R〇hl? I. ； Seif f ert, S .； Shanmugam,S.；Sood,V.；Soutschek,J.；Toudjarska, I.；Wheat, A.J.；Yaworski,E.； Zedalis,ff.；Koteliansky,V.；Manoharan,M.；Vornlocher,H.-P.；MacLachlan, I.Nature 2006,441,111-114.
[0156] (10)Spagnou,S.；Miller,A.D.；Keller,M.Biochemistry 2004,43,13348-13356.
[0157] (ll)Urban-Klein,B.；fferth,S.；Abuharbeid,S.；Czubayko,F.；Aigner,A.Gene Ther.2004,12,461-466.
[0158] (12)Lv，H.;Zhang，S.;Wang，B.;Cui，S.;Yan，J.J.Control.Release 2006,114， 100-109.
[0159] (13)Ma,Z. ；Li,J. ；He,F. ；ffilson,A. ；Li, S·Biochem·Biophys·Res·Commun·2005，330，755-759·
[0160] (14)Akhtar，S.;Benter，I.Adv.Drug Deliv.Rev.2007,59,164-182·
[0161] (15)Kurreck,J.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,1378.
[0162] (16)Nakagawa，0. ;Ming，X. ;Huang，L. ; Juliano，R.L. J· Am. Chem. Soc · 2010，132， 8848-8849.
[0163] (17)Alam，M.R.;Dixit，V.;Kang，H.;Li，Ζ·Β·;Chen，X.;Trejo,J.;Fisher，M.; Juliano，R.L.Nuc.Acids Res.2008,36,2764-2776.
[0164] (18)Alam，M.R. ;Ming，X. ;Dixit，V. ;Fisher，M. ;Chen，X. ;Juliano， R.L.Oligonucleotides 2010,20,103-109.
[0165] (19)Ming，X.;Alam，M.R.;Fisher，M.;Yan，Y.;Chen，X.;Juliano，R.L.Nucl.Acids Res.2010,38,6567-6576.
[0166] (20)0ishi，M. ;Nagasaki，Y. ;Itaka，K. ;Nishiyama，N. ;Kataoka， K.J.Am.Chem.Soc.2005,127,1624-1625·
[0167] (21)Leamon，C.P.;Low，P.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991，88,5572-5576.
[0168] (22)McNamara，J·0·;Andrechek，E·R·;Wang，Y.;Viles，K.D.;Rempel，R·E·; Gilboa，E.;Sullenger，B·A.;Giangrande，P.H.Nat.Biotech.2006,24,1005-1015.
[0169] (23)Lorenz,C.；Hadwiger,P.；John,M.；Vornlocher,H.P.；Unverzagt, C.Bioorg.Med.Chem.Lett.2004,14,4975-4977.
[0170] (24)Soutschek，J Akinc，A Bramlage，B Charisse，K Const ien，R ·; Donoghue,M.；Elbashir,S.；Geick,A.；Hadwiger,P.；Harborth,J.；John,M.；Kesavan,V.； Lavine,G.；Pandey,R.K.；Racie,T.；Rajeev,K.G.；Rohl, I.；Toudjarska, I.；Wang,G.； ffuschko,S.；Bumcrot,D.；Koteliansky,V.；Limmer,S.；Manoharan,M.；Vornlocher,H.-P.Nature 2004,432,173-178.
[0171] (25)Nishina，K.;Unno，T.;Uno，Y ? ;Kubodera，T·;Kanouchi，T·;Mizusawa，H·; Yokota，T.Mol.Ther.2008，16，734-740.
[0172] (26)Godfray,J.；Estibeiro,P.Expert Opin.Ther.Targets 2003,7,363-376.
[0173] (27)Wood，M. J.A. ;Triilzsch，B. ;Abdelgany，A. ;Beeson，D.Hum.Mol .Genet .2003， 12，R279-R284.
[0174] (28)Filion，M.C.;Phillips，N.C.Biochim.Biophys.Acta，Biomembr.1997，1329， 345-356.
[0175] (29)Pertwee,R.G.Pharmacol.Ther.1997,74,129-180.
[0176] (30)Devane，W·A·;Hanus，L·;Breuer，A·;Pertwee，R·G·;Stevenson，L·A·; Griffin，G.;Gibson，D.;Mandelbaum，A.;Etinger，A.;Mechoulam，R.Science 1992,258， 1946-1949.
[0177] (31)McFarland,M.J.；Porter,A.C.；Rakhshan,F.R.；Rawat,D.S.；Gibbs,R.A.； Barker，E.L.J.Biol.Chem.2004,279,41991-41997.
[0178] (32)McFarland,M.J.；Barker,E.L.Pharmacol.Ther.2004,104,117-135.
[0179] (33)Glaser,S.T.；Kaczocha,M.；Deutsch,D.G.Life Sci.2005,77,1584-1604.
[0180] (34)Burley,G.A.；Gierlich,J.；Mofid,M.R.；Nir,S.T.H.；Eichen,Y.；Care11, T.J.Am.Chem.Soc.2006，128，1398.
[0181] (35)Gierlich，J.;Burley，G.A.;Gramlich，P.M.E.;Hammond，D.M.;Carell， T.Org. Lett.2006,8,3639.
[0182] (36)Gramlich,P.M.E. ；ffarncke,S. ；Gierlich,J. ；Carell, T.Angew.Chem.Int. Ed.2008，47，3442.
[0183] (37)El-Sagheer，A.H. ;Brown，T.Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A. 2010,107,15329-15334.
[0184] (38)Aigner,M.；Hart1,M.；Fauster,K.；Steger,J.；Bister,K.；Micura, R.ChemBioChem 2011，12,47-51.
[0185] (39)Paredes,E.；Das,S.R.ChemBioChem 2011,12,125-131.
[0186] (40)Xia,ff.；Low,P.S.J.Med.Chem.2010,53,6811-6824.
[0187] (41)ffang,Y.；Juranek,S.；Li,H.；Sheng,G.；ffardle,G.S.；Tuschl,T.；Patel, D. J.Nature 2009,461,754-761.
[0188] (42)Ross,T.L.；Honer,M.；Lam,P.Y.H.；Mindt,T.L.；Groehn,V.；Schibli,R.； Schubiger,P.A.；Ametamey,S.M.Bioconjugate Chem.2008,19,2462-2470.
[0189] (43) Face i , L. ； Dal to so , R. ； Romanello , S ? ;Buriani，A·;Skaper，S·D·;Leon， A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,3376-3380.
[0190] (44)Rakhshan,F. ；Day,T.A. ；Blakely,R.D. ；Barker, E. L.J.Pharmacol.Exp.Ther.2000,292,960-967.
[0191] (45)ffong,B.R. ；Grossbard,E.B. ；Payan,D.G. ；Masuda,E.S.Expert Opin.Investig.Drugs 2004,13，743_762·
[0192] (46)Ulanova,M. ；Duta,F. ；Puttagunta,L. ；Schreiber,A.D. ；Befus,A.D.Expert Opin.Ther.Targets 2005，9，901_921·
[0193] (47)Sanderson,M.P.；Gelling,S.J.；Rippmann,J.F.；Schnapp, A.Cell. Immunol.2010,262,28-34.
[0194] (48)Martin,B.R.；J.Pharmacol.Exp.Ther.2002,301,790-796.
[0195] (49)S.Munro,K.L. Thomas,M.Abu-Shaar, Nature 1993,365,61-65
[0196] (50)A.B.LynnjM.HerkenhamjJ.Pharmacol.Exp.Ther.,1994,268,1612-1623.
[0197] (51 )L · Facci，R · Dal To so , S . Romanel lo , A. Buriani , S. D . Skaper , A. Leon , Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,3376-3380.
[0198] (52)L.A.Matsuda,S.J.Lolait,M.J.Brownstein,A.C.Young,T. I.Bonner,Nature 1990,346,561-564.
[0199] (53)M.Herkenham,A.B.Lynn,B.R.de Costa,E.K.Richfield,Brain Res.1991, 547,267-274.
[0200] (54)B.F.Thomas，X.Wie，B.R.Martin，J.Pharmacol.Exp.Ther.1992,263,1383-1390.
[0201 ] (55)T.M. Westlake，A.C.Howlett，T. I. Bonner，L. A.Matsuda，M.Herkenham， Neuroscience 1994，63，637-652.
【主权项】
1. 包含至少一个糖残基和至少一个核苷组分的缀合物在转染细胞，特别是植物细胞或 哺乳动物细胞，例如人细胞中的用途。2. 权利要求1所述的用途，其中在所述的缀合物中，至少一个糖残基与至少一个核苷组 分共价结合，或其中所述的缀合物包含至少一个核苷组分和与其非共价结合的糖修饰的部 分。3. 权利要求1或2所述的用途，其中所述的核苷组分选自核酸、核苷和核苷酸。4. 权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的核苷组分是核酸分子，特别是RNA 分子，例如任选地具有至少一个3 突出端的单链RNA分子或双链RNA分子，更特别地是 siRNA分子。5. 权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的核苷组分是包含至少一个修饰的 结构单元的核酸分子。6. 权利要求1-5中任意一项所述的用途，其中所述的核苷组分经由核碱基、糖或磷酸 基，特别是存在于核酸分子中的结构单元的核碱基、糖或磷酸基，特别是经由存在于核酸分 子中的末端结构单元，与所述的糖残基相连。7. 权利要求1-6中任意一项所述的用途，其中所述的糖残基选自单糖，例如葡萄糖、甘 露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖或唾液酸，二糖，例如蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽 糖，和线性的、分枝的或环状的寡糖，例如环糊精。8. 权利要求1-7中任意一项所述的用途，其中所述的缀合物包含： (i) 一个糖残基和一个核苷组分，例如一个核酸分子， (i i)多个糖基和一个核苷组分，例如一个核酸分子， (i i i) 一个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子，或 (iv)多个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子。9. 权利要求1-8中任意一项所述的用途，其中所述的缀合物包含糖残基，其与RNA转录 物例如mRNA的3 ' -或5 ' -端共价结合。10. 权利要求1-9中任意一项所述的用途，其中所述的糖残基经由接头与所述的至少一 个核苷组分或所述的部分共价结合。11. 权利要求10所述的用途，其中所述的接头包含由Click反应形成的环状基团，特别 是由炔和叠氮化物之间的Click反应形成的1，2,3_三唑基团，或由降冰片烯和腈亚胺、腈氧 化物或四嗪之间的Click反应形成的基团。12. 权利要求1-11中任意一项所述的用途，用于在体外转染细胞，特别是用于在体外转 染植物细胞或包括人细胞在内的哺乳动物细胞。13. 权利要求1-12中任意一项所述的用途，用于转染植物细胞。14. 权利要求书1-11中任意一项所定义的缀合物，其用于医学，特别是用于人类医学。15. 权利要求1-13中任意一项所述的用途或用于权利要求书14所述的用途的缀合物， 用于下调基因，例如病毒的基因或与细胞疾病相关联的基因，例如癌基因或与自身免疫病 相关联的基因。16. 生产权利要求1-11中任意一项所定义的缀合物的方法，所述的缀合物具有通式 (Ia)或（Ib)，其中糖残基与RNA分子的3或5端共价结合 Fn一(Lm_N'）r ( la) Fn-(Lm_N'）r-Lm-Fn (Ib) 其中 F是糖残基， L是接头， Ν'是RNA分子，例如mRNA， m是O或1， η是1-10，优选地1-5，更加优选地1的整数， r是1-25,优选地2-20以及更优选地2-8的整数， 该方法包括 (i) 使式V的试剂 Fn-(L1)m-(RGl)r (V) 其中 L'是接头，并且 RGl是反应基，特别是Click反应基，例如叠氮基， 与至少一种修饰的核酸分子(VII)偶联 (N，）r-(L，，）m-RG2 (VII) 其中 L"是接头，并且 RG2是能够与RGl反应的反应基，特别是Click反应基，例如炔基团， 从而形成所述的缀合物，或 (ii) 使通式(V)的试剂与至少一种修饰的核酸结构单元(VIII)偶联 BB-(Dm-RG2 (VIII) 其中BB是用于合成核酸分子的结构单元，并且 L"是接头， 并且把已经与所述的试剂偶联的结构单元掺入核酸分子中，从而形成所述的缀合物。17.转染细胞，优选地植物细胞的方法，包括使细胞暴露于在权利要求1 -11的任意一项 中所定义的缀合物。
【文档编号】C12N15/87GK105899666SQ201580003755
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月15日
【发明人】T·卡雷尔
【申请人】巴斯夫欧洲公司