专利名称：丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子药物及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物感染免疫和检验领域,具体涉及一种能特异性抑制丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染人细胞的小分子核苷酸序列(或称DNA适配子)，具有SEQIDN0.1-29所示的小分子核苷酸序列(或称单链DNA适配子)。同时还涉及制备能与丙型肝炎病毒特异结合，特异性拮抗丙型肝炎病毒感染的高亲合力的小分子DNA适配子的方法，小分子的DNA适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该DNA适配子核苷酸同时还作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的临床新型诊断试剂。
背景技术：
1989年首次鉴定出丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)，至今已有大约nO万的世界人口感染有HCV，我国感染者占全国总人口3.2%，其中80%的感染者发展成为慢性。HCV是HIV感染的5倍，并且艾滋病合并HCV感染发病率高达6(T/。 80%，并且我国HCV感染率将有可能逐渐升高。
医源性的输入HCV所污染的血液是丙型肝炎传播的主要方式，丙型肝炎发病缓慢及隐匿易形成慢性肝炎和肝硬化，后期常发展成为肝细胞性肝癌。临床上主要将a干扰素或将a干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，这种治疗方法往往也只是对早期病人的效果比较明显。目前无疫苗预防。因此在血液样品中正确及灵敏的检测HCV是防范HCV的关键。
HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒家族，基因组(大约9.6kb)含有一个开放阅读框编码3010氨基酸的蛋白前体。通过宿主和病毒蛋白水解酶的共同作用形成9个不同的结构和非结构蛋白，宿主信号肽的剪切后，HCV包膜糖蛋白E1(gp35)和E2(gp70)形成。虽然在分子水平上病毒感染和复制的确切机制还未明了，但是包膜糖蛋白E2在HCV病毒感染的初始和通过与人CD81为主的细胞受体分子的识别和结合，在宿主细胞的粘附和侵袭中都起到了十分关键性的作用已经被公认。
HCV-E2 DNA适配子作为早期诊断试剂及拮抗HCV的治疗药物，为献血者HCV的筛选、早期感染的确诊、抗HCV感染和丙型肝炎的治疗提供了一条新的途径。此外，适配子还将在某些方面取代抗体，成为一种新的受体抑制剂和检测试剂，其应用前景十分诱人。
SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对CT26-HCV-E2细胞进行筛选，并用CT26细胞进行反筛，以获得能特异性拮抗丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子(Aptamer)分子。为丙型肝炎病毒感染机制的研究，丙型肝炎治疗性新型药物和新型诊断试剂的开发而奠定基础。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子，该DNA适配子为预防和治疗丙型肝炎提供了新型的拮抗剂，可以克服临床只以a干扰素或将a干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，且只是对早期病人的效果比较明显，并且联合治疗副作用大。丙型肝炎无疫苗预防。
本发明的另一个目的是提供了一种制备能特异性拮抗丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的方法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、SELEX筛选、体外细胞水平抑制HCV-E2蛋白与受体的结合实验，HCV活病毒结合和抑制实验，得到能抑制HCV-E2蛋白结合DC-SIGN、 CD81等受体以及抑制活病毒侵袭肝细胞的DNA适配子。其优点在于DNA适配 子预防HCV的入侵和进一步扩散的同时无抗原性，容易被排泄。
本发明的再一个目的是在于提供了一种小分子DNA适配子在制备治疗或预防 丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途。其能特异抑制丙型肝炎病毒活病毒感 染人肝细胞；竞争性抑制丙型肝炎病毒与受体CD81的结合；抑制HCV包膜抗原 E2与人肝细胞的结合。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种能特异性拮抗丙型肝炎病毒的DNA适配子，其具有SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDN0.8, SEQIDN0.9, SEQIDNO.ll, SEQIDNO,12, SEQIDN0.13, SEQIDN0.14, SEQIDN0.15, SEQIDN0.16, SEQIDN0.17, SEQ薩0.18, SEQIDNO. 19， SEQIDNO.20, SEQIDN0.21， SEQIDNO,22, SEQIDN0.23, SEQIDN0.24, SEQIDN0.25, SEQIDN0.26， SEQIDN0.27, SEQIDN0.28， SEQIDN0.29所示的核苷酸序列。
一种能特异性拮抗丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的制备方法，按下列 歩骤顺序进行
1、 构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链 DNA(ssDNA)文库 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-Nm-GGGTCAATGCGTCATA-S' ，其中N代表碱基A, G, T, C中的任意一个，该文库的 容量约为1014 1015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性 内切酶五coRI的酶切位点；构建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，， 该引物中含有DNA限制性内切酶5awHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物 可由引物合成公司(赛百胜公司)合成。
2、 双链DNA (dsDNA)及单链DNA (ssDNA)文库的PCR扩增，保存每轮筛 选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库(共14轮)，保存，并以dsDNA文库为模 板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94'C 4min， 94°C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18~25个循环，72°C 7min。调节循环次数以获得最佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检 测，试剂盒回收纯化。
3、 PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的2g/100ml琼脂糖凝胶， 对步骤2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘 红色条带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒 纯化；
4、 SELEX筛选。每轮筛选所用的ssDNA量均为8 ug,使用前置于85'C水浴 15min后，迅速冰浴5min,取等量于筛选缓冲液(1Xbuffer)中与CT26-HCV-E2 细胞作用，37。C轻振30 min， 2000 rpm 5 min，弃上清，再加入筛选洗脱液
(1Xbuffer)反复洗涤4~6次。所得细胞用50 ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5min， 冰浴，用酚/氯仿(25: 24)抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛 选的模板。
上述SELEX筛选缓冲液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 5Ommol/L氯化钾(KC1) , 200mmol/L氯化钠(NaCl) , 0. 2mmol/L乙二胺四乙 酸(EDTA)， 5ml/100ml甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 5Ommol/L氯化钾(KC1), lmol/L氯化钠(NaCl)， 0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 5%甘油(Glycerol), 0. 5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
5、 为了获得特异性筛选，选用梯度筛选以增加选择压力。前三轮用108 CT26-HCV-E2细胞(Li PF， et al. ， K腦'"e,25: 1544-1551)筛选；
6、第四轮开始加入CT26 (Li PF, et al., Facd"e， 25: 1544-1551)细胞 进行反筛，收集第三轮中所得ssDNA适配子8 ug,使用前置于85'C水浴15min 后，冰浴5min，取筛选缓冲液/1 X与106CT26细胞作用，37。C振30 min， 2000 rpm 5 min,留上清，弃沉淀，将上清液与106CT26-HCV-E2细胞作用，方法同上述第4 步骤，离心后所得细胞用50 ul灭菌ddH20吹匀，IO(TC煮沸5 min,冰浴，用酚/ 氯仿/25: 24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模板，以此模板 扩增出下一轮筛选的ssDNA适配子。
7、重复上述第1至6步骤八次。第四至第六轮用106CT26-HCV-E2细胞筛选， 用106CT26细胞开始反筛；第七至第九轮用106CT26_HCV-E2细胞筛选，并用
81C^CT26细胞反筛；第十至十四轮用105CT26-HCV-E2细胞筛选，并用108CT26细 胞反筛，完成十四轮筛选。
8、比较各轮(十四)筛选后所得适配子库与CT26-HCV-E2细胞的亲合力，方 法同歩骤5，只是订购FITC标记的引物进行PCR，得到FITC-各轮适配子。分别 取各轮FITC-适配子8ug，与106CT26-HCV-E2细胞作用，流式细胞仪检测荧光强 度。通过检测，可知第十三轮适配子库与CT26-HCV-E2细胞的亲合力最大。将第 十三轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA限制性内切酶 五coRI和S"wHI消化，连于质粒pUC19 (Yanisch-Perron, C.， et a1.，1985)上，转化到
大肠杆菌DH5 cx (Hanahan, D.,1983; Tartof， K. D.,et a1.,1987)，氨节抗性筛选，挑
取单个生长菌落进行测序。小分子核苷酸适配子的序列编号为SEQIDNO.l， SEQIDN0.2, SEQ画0.3, SEQ画0,4, SEQIDNO.5, SEQIDN0.6, SEQ腦0.7, SEQIDN0.8, SEQIDN0.9， SEQIDNO.ll, SEQIDNO.12, SEQIDN0.13, SEQIDN0.14， SEQIDNO.l 5, SEQIDNO.l 6， SEQIDNO.l 7, SEQIDNO.l 8, SEQIDNO.19, SEQIDNO.20, SEQIDNO.21, SEQIDN0.22, SEQIDN0.23， SEQIDN0.24， SEQIDN0.25, SEQIDN0.26, SEQIDN0.27, SEQIDN0.28, SEQIDN0.29所示的核苷酸序列。
获得的小分子核苷酸适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的 药物中，有如下功能和用途作用
A、小分子核苷酸竞争性抑制HCV (ZhongJ， et al.， 2005， Proc Natl Acad Sci U S A， 102(26):9294-9)的受体CD81蛋白(Cao J, et al.， et al" 2007， J Microbiol Methods, 68(3):60卜4)与HCV包膜抗原E2的结合。CD81是HCV包膜糖蛋白E2的受体， 可以抑制适配子与CT26-HCV-E2细胞的结合。细胞分为两组300ng/100ul纯 化的CD81与细胞37。C孵育60分钟，2000rpm/min，细胞沉淀用PBS洗涤三次 后加入4ugFITC标记的适配子/100ul，孵育，洗涤同前。流式细胞仪检测荧光强 度。结果CD81对适配子库和单适配子均有抑制结合能力。说明CD81与适配子 竞争结合E2蛋白位点，不同单适配子与E2的结合位点有差异。这样适配子可 以作为治疗药物干扰丙肝病毒在体内与受体结合。
B、小分子核苷酸抑制HCV包膜抗原E2结合人肝癌细胞的实验 人肝癌细胞Huh7.5.1上具有天然的HCV受体，所以通过上述相似实验得到一致的抑制结果(结合率由36.7%抑制到15.4%)，说明适配子抑制GST-E2 (Li PF: etal.， 7ac"'"e, 25: 1544-1551.)蛋白与Huh7. 5. 1 (ZhongJ， etal.,2005,ProcNatl Acad Sci U S A， 102(26):9294-9)细胞结合的功能有剂量依赖关系同时有剂量饱和现象。
C.小分子DNA适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中 的用途即小分子核苷酸适配子特异抑制HCV活病毒感染人肝细胞的实验
免疫荧光法
(1) . Huh7.5.1细胞铺96孔板，37°C 5%C02;
(2) . HCV virus (3 X 105) 18ul病毒+样品(8ug和4ug aptamer适配子)37°C lhr; (三复孔，180ul/孔)
(3) . PBS洗涤细胞后，将孵育后的病毒加入到细胞中，37°C 5%C0， 5小时；
(4) .洗涤细胞后，加入培养基(DMEM)， 37°C 5%C0， 72小时；
(5) .洗涤细胞后，加入荧光标记的HCV-E2-PE抗体与细胞孵育；
(6) .洗涤细胞后，荧光显微镜下计数每孔红色荧光点数(ffu/we11， 580nrn)。
荧光实时定量RT-PCR法
胞内HCVRNA的定量釆用试剂盒QuantiTect SYBR Green PCR Handbook Kit
(QIAGEN公司)。Huh7.5.1细胞培养六孔板中，4.5 x 105/ L，加不同浓度的适配
子或其突变体，或500 U IFN-a以及200 jal JFHl-HCVcc (病毒含量为107copies).
于37 °C培养过夜。弃上清，用DEPC处理过的PBS洗细胞，利用TRIzol试
剂(Invi加gen Life Technologies公司)抽提细胞中的总RNAtotal RNA ，并用试剂
盒First Strand cDNA synthesis kit (Fergment公司)进行逆转录，在终体积为20
利用0.5ingoligo(dT)18作为引物，lnlRNase抑制剂，1 fal M-MLV逆转录酶，和
2nllOX逆转录缓冲液(Ambion公司)，在42°C 45 min ，然后75。C10min，进
一步合成 cDNA 。
HCV基因扩增的上下游引物分别为
5'AATGGCTCGAGGAAACTGTGAAGCGA3' ;
5'TTCATCATGCCAATGGTGTTCGTGGC3，； PCR反应条件是94。C，5min，然
后95°C 10 s, 58°C for 20 s，以及72。C 30 s，共45 cycles 。结果采用6.0.software
软件分析(Rotogene公司)。
免疫印迹Western blot方法Huh7.5.1细胞培养于六孔板中，4.5 x 105 cells/well,加不同浓度的不同浓 度的适配子或其突变体，或500 U IFN-oc以及200 pl JFHl-HCVcc (病毒含量 为107copies)，于37 °C培养过夜。细胞溶于200 |al SDS-上样缓冲液中，于 100。C5分，加样于12。/。SDS-PAGE聚丙稀酰胺凝胶电泳，电泳后将蛋白转 移至PVDF膜，用anti-E2抗体检测HCV-E2; (3-actin (内参)用anti.-(3-actin 抗体检测。
12.检测适配子的细胞毒性试验
(1) .接种Huh7.5.1细胞于96孔板，每孔约3X103个细胞
(2) .待细胞贴壁后，加入不同浓度的适配子，与细胞共同孵育72小时，每个浓 度做6个复孔
(3) .小心吸掉上清，加入80ul新鲜培养基，再加入20 ul 5mg/ml的MTT (四甲基 偶氮唑盐)，继续培养4小时
(4) .弃上清，每孔加入150ul DMSO (二甲基亚砜)，混匀，置摇床上低速震荡 IO分钟，使结晶物充分溶解。
(5) .酶标仪上检测OD57Q,计算IC50抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X 100%， lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率 测得单适配子IC5(^3.35X104ug/100ul二10.47mmol/L。
本发明的优点和效果
一能特异性的结合在细胞表面表达的丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2分子上， 可降低E2蛋白与人肝细胞的结合能力，明显抑制丙型肝炎病毒感染肝细胞。该 DNA适配子细胞毒性小，可直接作为丙型肝炎病毒的拮抗剂使用，可预防、检测
和治疗丙型肝炎。因为采用了新的组合化学技术-SELEX技术进行丙型肝炎病毒结构蛋白的DNA适配子的筛选，确保了获得的DNA适配子可特异性结合在丙型肝 炎病毒毒力因子上，从而封闭了丙型肝炎病毒结合受体CD81的位点，使其不能 进入宿主细胞，从而不能在机体细胞内滞留留和增殖，有利于免疫系统对其清除。 二为早期和灵敏地检测丙型肝炎病毒提供了有效和有力的手段。医源性的 输入HCV所污染的血液是丙型肝炎传播的主要方式，丙型肝炎发病缓慢及隐匿易 形成慢性肝炎和肝硬化，后期常发展成为肝细胞性肝癌。目前无疫苗预防。因此 在血液样品中正确及灵敏的检测HCV是防范HCV的关键。目前临床广泛采用 ELISA方法检测HCV抗体而确诊HCV的感染。但是，HCV感染早期无抗体产生；对于 某些因移植或HIV感染而免疫缺陷的病人若伴有HCV感染则检测不到抗体；此外 ELISA的抗体检测结果常出现假阳性或假阴性。现有的辅助核酸检测法(RT-PCR) 成本高，易污染，不适宜于临床应用。检测HCV的另一方法是应用抗体检测HCV 的抗原即核心蛋白及E1或E2包膜糖蛋白，但高质量的抗体的要求使得该方法不可 实施，但针对抗原而行早期诊断不失为正确的思路，DNA适配子就是我们寻找到 优于抗体的诊断试剂。
三为克服临床上无疫苗预防，治疗方法单一，效果不佳，毒副作用大的情 况，提供了新的解决途径。目前临床上主要将(x干扰素或将a干扰素和病毒唑等 抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，这种治疗方法往往也只是对早期病人的 效果比较明显，但是80%的感染者将发展成为慢性。本发明制备的DNA适配子 为小分子核酸，其分子结构不同与任何广谱抗生素，因而无耐药性之忧；同时 DNA适配子只针对丙型肝炎病毒发挥作用，对人体内的多种有益菌群和细胞并 无危害。DNA适配子也有别于传统的蛋白质抗体，其分子量小，可快速渗入细 胞，无抗原性，不引起副作用。
此外，该DNA适配子及适配子库已克隆到pUC19质粒上，并且该质粒已转化
到大肠杆菌DH5 oc中，可直接用该菌株进行大规模生产制备。
图1.表达HCV-E2蛋白的稳定细胞系CT26-HCV-E2细胞的建立，E2蛋白 表达在CT26-HCV-E2细胞表面显著高于CT26, E2-CT26可作为靶细胞用于筛选 HCV-E2适配子。A: CT26-HCV-E2细胞表面表达的E2蛋白;B: CT26-HCV-E2细
胞质中表达的E2蛋白。
12图2. CELL-SELEX技术筛选特异性拮抗丙型肝炎病毒适配子实验流程示意图。
用合成的随机单链寡核苷酸文库与CT26-HCV-E2细胞作用，去掉不能结合的 部分，筛选三轮后加入CT26细胞进行反筛，共筛选十四轮。SELEX筛选能结合 E2-CT26细胞，而不能结合CT26细胞的适配子的筛选过程。
图3.单链DNA和双链DNA的扩增示意图。
每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模 板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。图中比较ssDNA和dsDNA的电泳迁移率PCR 后dsDNA和ssDNA适配子的鉴定(M:Marker 1 5:ssDNA 6 10:dsDNA)。
图4. CT26-HCV-E2细胞吸附各轮筛选后所得到的ssDNA适配子库的能力比
较示意图。
全部筛选完后，分别取8ug每轮筛选后得到的ssDNA与106 CT26-HCV-E2 细胞作用，发现第十三库适配子库与细胞有最强的结合能力，结合力呈现剂量依 赖性。A:第13轮筛选出的适配子库结合E2-CT26的能力最强(89%),比12库， 10库等均强；B:将13轮库适配子克隆后得到的单适配子与E2-CT26的结合能力 呈剂量依赖性。
图5. HCV的E2的受体CD81蛋白能抑制筛选的适配子库(13库，12库)和 单适配子与E2的结合。CD81蛋白是HCV包膜糖蛋白E2的受体，用300ng/100ul 纯化的CD81蛋白和细胞孵育后加入4ug FITC标记的适配子/100ul，同时做无 CD81蛋白处理对照组。结果CD81蛋白对适配子库(十三库由10. 2%抑制为7. 6%) 和单适配子(14.8%下降为5.8%)均有抑制结合能力，尤其是单适配子抑制作用 明显。图示说明筛选的适配子库(13库，12库)和单适配子能部分抑制HCV-E2 与其受体的结合。4thP:代表第4轮筛选的库，12thP:代表第12轮筛选的库， 13thP:代表第13轮筛选的库。单适配子是从13thP 13库中克隆得到的单适配子 .图6.适配子能抑制HCV-E2蛋白与人肝细胞的结合
适配子抑制GST-E2蛋白质与Huh7细胞的结合。人肝癌细胞系Huh7上具有 天然的HCV受体，该细胞与GST蛋白结合率为1%，与E2蛋白结合率为36.7先， 加入十三库适配子后结合率下降为23. 2%,，加入单适配后下降为15.4%,说明适 配子可以阻断HCV与其受体的结合。lstP:代表第1轮筛选的适配子库；6thP:代表第6轮筛选的适配子库；13thP: 代表第13轮筛选的适配子库。
图7.适配子抑制HCV活病毒对肝细胞的感染。并曾剂量依赖性。A筛选的 单适配子抑制HCV JFH-1病毒对肝细胞Huh7. 5. 1的感染，且呈剂量依赖性。7A 图为免疫荧光显微镜检测；7B:荧光实时定量RT-PCR检测适配子能抑制HCVcc 感染肝细胞Huh7. 5. 1，且呈剂量依赖性；7C: Western blot检测适配子能抑制 HCVcc感染肝细胞Huh7. 5. 1,且呈剂量依赖性；7D:免疫共聚焦显微镜观察适配 子能抑制HCVcc感染肝细胞Huh7. 5. 1，而适配子突变体没有明显抑制能力。
图8适配子的细胞毒性试验结。单适配子IC50=3. 35 X 104ug/100ul = 10. 47raiol/L
具体实施例方式
一种能结合而抑制丙型肝炎病毒感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.
(1-29)所示的核苷酸序列。
一种能结合而抑制丙型肝炎病毒感染的DNA适配子的制备方法按下列步骤
顺序进行
1、 构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链 DNA(ssDNA)文库 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N '-GGGTCAATGCGTCATA-3'，其中N代表碱基A, G， T, C中的任意一个，该文库的 容量约为1014 1015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3，，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性 内切酶五coRI的酶切位点；构建下游引物5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，， 该引物中含有DNA限制性内切酶S膽HI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物 可由上海生物工程公司合成。
2、 双链DNA (dsDNA)及单链DNA (ssDNA)文库的PCR扩增每轮筛选前先 将ssDNA文库扩增成dsDNA文库(共14轮)，保存，并以dsDNA文库为模板扩增 出下一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94°C 4min， 94 °C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18~25个循环，72°C 7min。调节循环次数 以获得最佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5g/100ml的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化。
3、 PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的2y。琼脂糖凝胶，对步骤 2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条 带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；
4、 SELEX筛选。为了获得特异性筛选，采用梯度筛选以增加选择压力。前三 轮用10tT26-HCV-E2细胞筛选；第四轮至第六轮用10fiCT26-HCV-E2细胞筛选， 并用10bCT26细胞开始反筛；第七至第九轮用10tT26-HCV-E2细胞筛选，并用 107(^26细胞反筛；第十至十四轮用105CT26-HCV-E2细胞筛选，并用108CT26细 胞反筛。每轮筛选所用的ssDNA量均为8 ug,使用前置于85。C水浴15min后，
迅速冰浴((TC) 5min，取适量于筛选缓冲液(1Xbuffer)中与细菌感作，37°C
轻振30 min， 2000 rpm 5 min,弃上清，再加入筛选洗脱液(1Xbuffer)反复
洗涤4~6次。所得细胞用50 ul灭菌ddH20吹匀，煮沸(100°C ) 5 min,冰浴(0
"C)，用酚/氯仿(25: 24)抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛 选的模板。
上述SELEX筛选缓冲液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)， 50mmol/L氯化钾(KC1) , 200mmol/L氯化钠(NaCl) , 0. 2minol/L乙二胺四乙 酸(EDTA)， 5ml/100ml甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 50mmol/L氯化钾(KC1)， lmol/L氯化钠(NaCl)， 0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 5ml/100ml甘油(GlyceroI)， 0, 5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
5、 完成十四轮筛选后，比较各轮筛选后所得适配子库与结核杆菌的结合能力， 方法同步骤5，分别取各轮适配子8ug，与106CT260HCV-E2细胞作用，紫外分光 光度计260nm检测作用后剩余的单链DNA量。通过检测，可知第十三轮适配子库 与结核杆菌的结合能力最大。
6、 将第十三轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA 限制性内切酶五coRI和B,HI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5
a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序；
获得的小分子核苷酸适配子有如下功能和作用A.小分子核苷酸竞争性抑制丙型肝炎病毒(HCV)的受体CD81与HCV包膜
抗原E2的结合
CD81是HCV包膜糖蛋白E2的受体，可以抑制适配子与CT26-HCV-E2细 胞的结合。细胞分为两组300ng/100ul纯化的CD81和细胞37'C孵育60分钟， 2000rpm/min，细胞沉淀用PBS洗涤三次后加入4ug FITC标记的适配子/100ul， 孵育，洗涤同前。 一组未经CD81处理。流式细胞仪检测荧光强度。结果CD81 对适配子库和单适配子ZE16均有抑制结合能力，尤其是ZE16抑制作用明显， 但单适配子ZE14和ZE25结合力无该作用。说明CD81与适配子竞争结合E2蛋 白位点，单适配子与E2的结合位点有差异。这样适配子可以作为治疗药物干扰 丙肝病毒在体内与受体结合。
B、小分子核苷酸适配子抑制HCV包膜抗原E2与人肝细胞结合的实验 人肝癌细胞Huh7.5.1上具有天然的HCV受体，所以通过上述相似实验得到 一致的抑制结果(结合率由36.7%抑制到15.4%),说明适配子抑制GST-E2蛋白 与Huh7细胞结合的功能有剂量依赖关系同时有剂量饱和现象。 C.小分子核苷酸适配子作为制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中 的用途即小分子核苷酸适配子特异抑制HCV活病毒感染人肝细胞的实验 免疫荧光法
(1) . Huh7.5.1细胞铺96孔板，37°C 5%C02;
(2) . HCV vims (3 X 105) 18ul病毒+样品(8ug和4ug aptamer适配子)37°C lhr; (三复孔，180ul/孔)
(3) . PBS洗涤细胞后，将孵育后的病毒加入到细胞中，37°C 5%CO, 5小时；
(4) .洗涤细胞后，加入培养基，37°C 5%CO， 72小时；
(5) .洗涤细胞后，加入荧光标记的HCV-E2-PE抗体与细胞孵育；
(6) .洗涤细胞后，荧光显微镜下计数每孔红色荧光点数(ffu/wdl， 580nm)。
荧光实时定量RT-PCR法
胞内HCVRNA的定量采用试剂盒QuantiTect SYBR Green PCR Handbook Kit
(QIAGEN公司)。Huh7.5.1细胞培养六孔板中，4.5xl0V L，加不同浓度的适配
子或其突变体(4ug/100ul， 8ug/100ul， 16ug/100ul;其突变体为2个碱基的改变)，
或500 U IFN-a以及200 |_d JFHl-HCVcc (病毒含量为107copies).于37 °C培养
过夜。弃上清，用DEPC处理过的PBS洗细胞，利用TRIzol试剂(Invitrogen Life
16Technologies公司)抽提细胞中的总RNA total RNA ，并用试剂盒First Strand cDNA synthesis kit (Fergment公司)进行逆转录，在终体积为20 |_il，利用0.5吗 oligo(dT)18作为引物，l^lRNase抑制剂，1 |al M-MLV逆转录酶，禾卩2^1 10X 逆转录缓冲液(Ambion公司)，在42°C 45 min ,然后75。C10min，进一步合成 cDNA 。 HCV 基因扩增的上下游引物分别为 5'AATGGCTCGAGGAAACTGTGAAGCGA3' ; 5TTCATCATGCCAATGGTGTTCGTGGC3，； PCR反应条件是94。C，5min，然 后95°C 10 s, 58°C for 20 s,以及72°C 30 s，共45 cycles 。结果采用Rotogene公 司软件分析。
免疫印迹Western blot方法
Huh7.5.1细胞培养于六孔板中，4.5 x 105 cells/wdl，加不同浓度的不同浓 度的适配子或其突变体(4ug/100ul， 8ug/100ul， 16ug/100ul;其突变体为2个碱 基的改变)，或500 U IFN-a以及200 pi JFHl-HCVcc (病毒含量为107copies)，于 37 °C培养过夜。细胞溶于200 |al SDS-上样缓冲液中，于100°C 5分，加样于 12。/。SDS-PAGE聚丙稀酰胺凝胶电泳，电泳后将蛋白转移至PVDF膜，用anti-E2 抗体检测HCV-E2; p-actin (内参)用anti.-(3-actin抗体检测。 D.检测适配子的细胞毒性试验
(1) .接种Huh7.5.1细胞于96孔板，每孔约3 X 103个细胞
(2) .待细胞贴壁后，加入8个不同浓度的适配子(0.5 100ug/100ul)，每个浓度 做6个复孔
(3) .与细胞共同孵育72小时，每孔加入20 ul 5mg/ml的MTT，继续培养4小时
(4) . 4小时后弃上清，每孔加入lOOul DMSO终止反应
(6).酶标仪上检测OD570，计算IC50抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X 100%， lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg最大剂量 I:lg(最大剂量湘临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率 测得单适配子IC50二3.35 X 104ug/100ul=10.47mmol/LSEQUENCE LISTING
〈110〉武汉大学 〈120〉武汉大学
〈130〉丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子药物及制备方法和用途 〈140〉 10
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权利要求
1、一种分离的核酸，其特征在于小分子核苷酸适配子；所述的小分子核苷酸适配子序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29所示的核苷酸序列。
2、 权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的制备方法， 它包括下列步骤a、 构建单链DNA文库5' -GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGA GCC-N:,。-GGGTCAATGCGTCATA-3，， 构 建 上 游 引 物 5' -GCGGAATTCTAATACGACTCACTA TAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，构建下游引物 5' -GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3';b、 将歩骤a中单链DNA文库扩增成双链DNA，保存；筛选前将ssDNA文库扩 增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库； 单链DNA文库2ul、上游引物0. lnmol、下游引物0. l腸l、 25mraol/LMgCl2 6ul、 2mmol/L dNTP 10ul, 10倍DNA聚合酶反应缓冲液10ul和DNA聚合酶2. 5个活 性单位，加入双蒸水/ddH20中，使总体积为lOOul;然后放入PCR仪中，反应程 序设定为94°C 4min, 94°C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18 25个循环， 72°C 7min， i周节循环次数18~25;c、 将步骤b中的PCR扩增产物用含0. 5ug/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶进行 电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条带的PCR扩增产物切下， 用DNA纯化回收试剂盒纯化；d、 收集步骤c中所得ssDNA适配子8 ug，使用前置于85'C水浴15min后， 冰浴5min,取筛选缓冲液/1 X与108CT26-HCV-E2细胞作用，37。C振30 min， 2000 rpra 5 min，弃上清，再加入筛选洗脱液/1 X反复洗涤4 6次，所得细胞用50 ul 灭菌ddH20吹匀，煮沸5 min，冰浴，用酚氯仿25: 24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模板，以此模板进行单链扩增，并用步骤c纯化， 得到下一轮筛选的ssDNA适配子；e、重复步骤d 二次，将步骤d中收集步骤c中所得ssDNA适配子8 ug用筛 选后所得的适配子代替；f 、收集步骤e中所得ssDNA适配子8 ug，使用前置于85'C水浴15min后， 冰浴5min,取筛选缓冲液/lX与106CT26细胞作用，37。C振30 min， 2000 rpm 5 min,留上清，弃沉淀，将上清液与106CT26-HCV-E2细胞作用，方法同上，离心后 所得细胞用50 ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5 min，冰浴，用酚氯仿25: 24抽 提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模板，以此模板扩增出下一轮 筛选的ssDNA适配子；g、 重复a-f步骤a—f八次，将步骤f中收集步骤e中所得ssDNA适配子8 ug用筛选后所得的适配子代替，重复步骤f第三次至第五次时，将步骤f中CT26 细胞改为107 ，将CT26-HCVE2细胞改为106 ，重复步骤f第六次至第十次时， 将歩骤f中CT26细胞改为108 ，将CT26-HCV-E2细胞改为105 ;完成十四轮筛 选；h、 比较十四轮筛选所得到的ssDNA与CT26-HCV-E2细胞的亲合力，将与细胞 亲合力最高的一轮适配子库用步骤(b)的方法扩增成dsDNA;经DNA限制性内 切酶化oRI和S孤HI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5 a ，氨苄抗 性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。
3、 根据权利要求2所述的一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的制备 方法，其特征在于所述步骤(f)的筛选是用CT26-HCV-E2细胞进行正筛，用 CT26细胞进行反筛。
4、 根据权利要求2所述的一种能特异性拮抗丙型肝炎病毒的DNA适配子的 方法，其特征在于所述步骤(d)的SELEX筛选缓冲液/2X为25mmol/L崔氏碱 盐酸缓冲液、50腿ol/LKCl、 200鹏ol/LNaCl、 0. 2腿ol/L乙二胺四乙酸、5%甘 油、0. 5mmol/L二硫苏糖醇；所述的SELEX筛选洗脱液/2X为25mmol/L崔氏 碱盐酸缓冲液、5O咖ol/LKC1、 lmol/LNaCl、 0. 2ramol/L乙二胺四乙酸、5%甘 油、0. 5mniol/L二硫苏糖醇；所述的离心其转速为12000转/分钟，时间为5分 钟。
5.权利要求1所述的一种小分子核苷酸适配子在制备治疗或预防丙型肝炎 病毒感染人细胞的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子药物及制备方法和用途，DNA适配子序列为SEQ ID No.1-29所示的核苷酸序列，其步骤是首先是构建随机单链DNA文库的；其次是合成双链DNA文库；第三是SELEX筛选；第四是PCR扩增；第五是克隆和测序；第六是通过体外细胞水平实验证实DNA适配子的效果。小分子核苷酸适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该DNA适配子可直接作为丙型肝炎病毒拮抗剂和诊断试剂使用，可用于预防、检测和治疗丙型肝炎，克服临床只以α干扰素或将α干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，α干扰素和病毒唑联合治疗副作用大。并且目前丙型肝炎无疫苗预防。
文档编号C12N15/11GK101481685SQ20081019731
公开日2009年7月15日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者章晓联, 芳 陈 申请人:武汉大学