专利名称：抗结核杆菌感染的小分子核苷酸dna适配子及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物感染免疫和检验领域，具体涉及一种能抑制感染人的结核杆 菌(Mj;co6a"en'w附71^ercw/os/^〃J7AV) [ATCC 93009(4)]的DNA适配子(Aptamer)， 具有 SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3, SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7, SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO所示的核苷酸 序列。同时还涉及制备一种能与感染人的结核杆菌特异结合，抑制结核杆菌感染 的高亲和DNA适配子的方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycokzcfen'wM rw&ra^w")感染人体导致的结核病是一种 严重危害人民身体健康的慢性传染病。结核病是历史上患病率及死亡率最高的疾 病之一。上世纪50年代以来，结核病的流行在一定程度上得到了控制。80年 代中期以来，由于耐药结核菌的流行和艾滋病的传播蔓延等因素，使一些己经控 制了结核病疫情的国家出现了疫情进一步加重或扩散流行的局面，结核病疫情又 有进一步抬头的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分 之一的人感染结核杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结 核病，新增患者880万人。1993年，世界卫生组织宣布"全球结核病处于紧急 状态"，把结核病列为重点控制的传染病之一。我国是结核病高负担国家，国务 院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。因此，加强对结核病的研发力
3度，急待研制新型抗结核新药，以便对该病进行有效的治疗和预防，具有很大的 研究价值和社会效益。
SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系 统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本 原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集 与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核 苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应 用范围十分广泛。己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、 蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等 特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡 核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前 景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速 在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断 和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对H37Rv进行筛选， 并用BCG进行反筛，以获得能拮抗结核分枝杆菌表面毒力成分的生物活性小分子 核苷酸Aptamers分子。为结核杆菌感染机制的研究，结核病治疗性新型药物和 新型诊断试剂的开发而奠定基础。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，该DNA适 配子为预防和治疗结核病提供了新型的拮抗剂，可以克服临床常用药物利福平 (rifampin)、链霉素(str印tomycin)等治疗周期长，副作用大的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种制备能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的方 法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、 SELEX筛选、体外抑制细菌侵袭实验，得到能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA适 配子，并通过动物实验检测效果好，准确率高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3, SEQIDN0.4, SEQIDN0.5, SEQIDN0.6, SEQIDN0.7, SEQIDN0.8,SEQIDN0.9, SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。
一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法，按下列步骤顺序进行:
1、 构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链 DNA(ssDNA)文库 5'_GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N3。-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表碱基A， G， T, C中的任意一个，该文库的 容量约为1014 1015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTMTACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性 内切酶ficoRI的酶切位点；构建下游引物5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，， 该引物中含有DNA限制性内切酶A7mHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物 可由引物合成公司合成。
2、 双链DNA (dsDNA)及单链DNA (ssDNA)文库的PCR扩增，保存每轮筛 选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下 一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94°C 4min， 94°C 30s， 56°C 45s， 72°C lmin30s， 18~25个循环，72°C 7min。调节循环次数以获得最 佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒 回收纯化。
3、 PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的2y。琼脂糖凝胶，对步骤 2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条 带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；
4、 SELEX筛选。每轮筛选所用的ssDNA量均为8 ug，使用前置于85。C水浴 15min后，迅速冰浴5min,取等量于筛选缓冲液(1Xbuffer)中与细菌作用，37 。C轻振15 min, 12000 rpm 5 min,弃上清,再加入筛选洗脱液(1Xbuffer)反 复洗涤4~6次。所得细菌用50 ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5 min，冰浴，用酚/氯 仿(25: 24)抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛选的模板。
上述SELEX筛选缓冲液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 5Ommol/L氯化钾(KC1) , 200mmol/L氯化钠(NaCl) ， 0. 2mmol/L乙二胺四乙 酸(EDTA), 5%甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 50i咖ol/L氯化钾(KCl)， lmol/L氯化钠(NaCl)，0.2mraol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5%甘油(Glycerol), 0. 5誦ol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
5、 为了获得特异性筛选，选用梯度筛选以增加选择压力。前三轮用108CFU (菌落形成单位)H37RV (购自北京药物制品研究所)筛选；
6、 第四轮开始加入BCG进行反筛，收集第三轮中所得ssDNA适配子8 ug， 使用前置于85。C水浴15min后，冰浴5min,取筛选缓冲液/1 X与106 CFU BCG (购 自北京生物制品研究所)作用，37。C振15 min， 12000 rpm 5 min，弃上清，再 加入筛选洗脱液/lX洗涤，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，将上清液与107CFU H37Rv作用，方法同上，离心后所得细菌用50 ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5 min, 冰浴，用酚/氯仿/25: 24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模 板，以此模板扩增出下一轮筛选的ssDNA适配子。
7、 重复上述步骤八次。第四至第六轮用107CFU H37RV筛选，用106CFU BCG 开始反筛；第七至第九轮用106CFU H37RV筛选，并用107CFU BCG反筛；第十至 十二轮用105CFU H37RV筛选，并用108CFU BCG反筛，完成十二轮筛选。
8、 比较各轮筛选后所得适配子库与结核杆菌的亲合力，方法同步骤5，分别 取各轮适配子8ug，与108CFU的H37RV作用，紫外分光光度计260nm检测作用 后剩余的单链DNA量。通过检测，可知第十轮适配子库与结核杆菌的亲合力最大。 将第十轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA限制性内切 酶5coRI和3awHI消化，连于质粒pUC19 (Yanisch-Perron, C., et a1.,1985)上，转化
到大肠杆菌DH5 oc(Hanahan, D.,1983; Tartof, K. D.,et a1.，1987)，氨节抗性筛选，
挑取单个生长菌落进行测序，得到上述SEQIDNO.l, SEQIDN0.2， SEQIDN0.3, SEQIDN0.4, SEQIDN0.5, SEQ腿0.6, SEQIDN0.7, SEQIDN0.8, SEQIDN0.9, SEQIDNO.10所p的核苷酸序列。
本发明的优点和效果-
一能特异性的结合在结核杆菌致病过程中发挥作用的毒力因子，可降低结 核杆菌侵入巨噬细胞的能力，抑制结核杆菌感染小鼠。DNA适配子可直接作为结
核杆菌的拮抗剂使用，可预防和治疗结核病。因为采用了新的组合化学技术一
SELEX技术进行结核杆菌全菌的DNA适配子的筛选，确保了获得的DNA适配子可 特异性结合在结核杆菌菌体毒力因子上，从而封闭了结核杆菌的致病位点，使其
6不能进入巨噬细胞，从而不能在机体内持留和增殖，有利于免疫系统对其清除。 二为克服临床上结核治疗出现的日益严重的耐药问题和副作用大的情况， 提供了新的解决途径。目前治疗伤寒感染多釆用广谱抗菌素，如异燕肼 (isoniazid)、利福平(rifampin)、链霉素(str印tomycin)、吡嗪酰胺 (pyrazinamide)、乙胺丁醇(etambutol)和氨硫脲(bethiozone)，这些药物不仅 杀伤结核杆菌也杀伤寄生在人体内的多种有益菌群，并且副作用大，周期长；同 时结核杆菌的对这些药物产生的耐药问题也日益严重。本发明制备的DNA适配 子为小分子核酸，其分子结构不同与任何广谱抗生素，因而无耐药性之忧；同时 DNA适配子只针对结核杆菌发挥作用，对人体内的多种有益菌群并无危害。DNA 适配子也别于传统的蛋白质抗体，其分子量小，可快速渗入细胞，无抗原性， 不引起副作用。
三由下表可知，动物实验中，小鼠攻毒后19天取肺脏和脾脏进行细菌计 数，可发现用DNA适配子处理结核杆菌H37Rv后，结核杆菌的数目明显要少于未 加DNA适配子处理组。说明本发明的适配子能有效地抑制结核杆菌侵入巨噬细 胞，促进了结核杆菌在机体内的清除，可以直接作为结核杆菌的拮抗剂使用。此 外，该DNA适配子及适配子库已克隆到pucl9质粒上，并且该质粒已转化到大肠
杆菌DH5a中，可直接用该菌株进行大规模生产制备。
GroupLung(CFU)Spleen (CFU)
H37Rv1.3><1071參106
H37Rv+NK21.19xl077.0M05
H37Rv+aptamers pool2.9，<1061.5xl0
图1. SELEX技术筛选特异性抑制结核感染适配子示意图。
用合成的随机单链寡核苷酸文库与结核杆菌有毒株H37Rv作用，去掉不能 结合的部分，筛选三轮后加入BCG进行反筛，共筛选十二轮。
图2.单链DNA和双链DNA的扩增示意图。
每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模
7板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。此图选用第3， 5， 7， 9， ll轮的ssDNA和 dsDNA作为示例。
图3.有毒株结核杆菌吸附各轮(3~12)筛选后所得到的ssDNA适配子的能力比 较示意图。
全部筛选完后，分别取8ug每轮筛选后得到的ssDNA与108CFU H37Rv作用， 发现第十轮适配子库于结核杆菌有最强的结合能力。
图4A、 4B.等温滴定量热法检测核苷酸SEQIDNO.l与H37Rv和BCG亲合力示 意图。
以Microcal公司提供的Origin 5.0软件对SEQIDNO.l适配子和细菌反应的 稀释热进行双位点模型非线性最小方差拟和，可以得到SEQIDNO.l适配子和细 菌作用的本征结合常数Ka。其中SEQIDNO.l适配子与BCG的结合常数分别为 Kla: 7.20xl04(土3.6xl()3)Lmor1， AG尸3.124xl05(±3.674xl04)J; K2a: 1.52xl()5(土9.8xl03)Lmor1， AG2= 7.247xl04(±2.94xl03)K图4A)。而SEQIDNO.l 适配子与H37Rv的结合常数分别为Kla: 1.84xl04(±1.5xl03) Lmol", AG产 6.248xl05(±4.517xl04)J; K2a: 7.65xl05(±6.0xl04) Lmol-1, AG2= -3.739xl05(±8.968xl04)J (图4B)。从数据可知，SEQIDNO.l适配子与结核杆菌 有两个结合位点，与BCG结合时，都为吸热反应，而与H37RV结合时，其中一 个位点为放热反应，且亲合力较高，说明反筛是有效的，因而筛选所得到的适配 子特异性的。
图5.抑制结核杆菌侵袭巨噬细胞的能力示意图。
由图可知，结核杆菌和适配子作用后侵入巨噬细胞的数量明显减少， SEQIDNO.1-10混合适配子的作用比单个SEQIDNO.l适配子的作用更为明显。
图6.适配子延长小鼠生存时间和提高生存率示意图。
适配子在与结合杆菌作用后，可以明显延长小鼠感染结核杆菌后的生存时 间，并且生存率也得到提高。其中A为结核杆菌H37Rv感染小鼠组，B为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.l适配子作用后感染小鼠组，C为结核杆菌H37Rv和 SEQIDNO.l-10混合适配子作用后感染小鼠组。从图中可以看出，结核杆菌与适 配子作用后，半数死亡率可推迟3天，生存率可提高l倍。
图7.适配子对结核杆菌损害小鼠肺脏的病理改变示意图。,
由图可知，结合杆菌在与适配子作用后，对小鼠肺脏病理损害明显减轻。其 中A为正常小鼠肺脏,B为结核杆菌H37Rv感染小鼠肺脏，C为结核杆菌H37Rv 和SEQIDNO.l适配子作用后感染小鼠肺脏，D结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.1-10
混合适配子作用后感染小鼠肺脏。
图8.适配子减少结核杆菌感染小鼠后肺脏带菌量示意图。
抗酸染色证实，结核杆菌H37Rv与适配子作用后感染小鼠，与未与适配子 作用相比，小鼠肺脏的带菌量明显减少。其中A为为结核杆菌H37Rv感染小鼠 肺脏，B为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.l适配子作用后感染小鼠肺脏，C结核 杆菌H37Rv和SEQIDNO.I-10混合适配子作用后感染小鼠肺脏，D为链霉素治 疗后小鼠肺脏，箭头所指为结核杆菌。
具体实施例方式
一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO. (1-10)所示的
核苷酸序列。
一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法按下列步骤顺序进行 K构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链 DNA(ssDNA)文库 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N3。-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表碱基A， G， T, C中的任意一个，该文库的 容量约为1014 1015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性 内切酶￡coRI的酶切位点；构建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3'， 该引物中含有DNA限制性内切酶S"mHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物可由上海生物工程公司合成。
2、 双链DNA (dsDNA)及单链DNA (ssDNA)文库的PCR扩增每轮筛选前先 将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛 选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94°C 4min， 94°C 30s， 56 °C 45s， "72。C lmin30s， 18~25个循环，72 °C 7min。调节循环次数以获得最佳 扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检领||，试剂盒回 收纯化。
3、 PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的2y。琼脂糖凝胶，对步骤 2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条 带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；
4、 SELEX筛选。为了获得特异性筛选，采用梯度筛选以增加选择压力。前三 轮用1(TCFUH37RV筛选；第四轮至第六轮用106CFUH37RV筛选，并用106CFUBCG 开始反筛；第七至第九轮用106CFU H37RV筛选，并用107CFU BCG反筛；第十至 十二轮用105CFU H37RV筛选，并用108CFU BCG反筛。每轮筛选所用的ssDNA量
均为8 ug,使用前置于85。C水浴15min后，迅速冰浴(0°C) 5min，取适量于筛
选缓冲液(lXbuffer)中与细菌感作，37t轻振15 min， 12000 rpm 5 min， 弃上清，再加入筛选洗脱液(1Xbuffer)反复洗涤4~6次。所得细菌用50 ul 灭菌ddH20吹匀，煮沸(100°C) 5min,冰浴((TC)，用酚/氯仿(25: 24)抽提，
取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛选的模板。
上述SELEX筛选缓冲液(2X)为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)， 50mmol/L氯化钾(KC1) , 200mmol/L氯化钠(NaCl) , 0. 2腿ol/L乙二胺四乙 酸(EDTA)' 5%甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)， 5Ommol/L氯化钾(KC1), lmol/L氯化钠(NaCl)，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 50/o甘油(Glycero1)， 0. 5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
5、 完成十二轮筛选后，比较各轮筛选后所得适配子库与结核杆菌的结合能力， 方法同步骤5，分别取各轮适配子8ug，与K)8CFU的H37RV作用，紫外分光光度 计260nm检测作用后剩余的单链DNA量。通过检测，可知第十轮适配子库与结核
106、将第十轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA限制
性内切酶五coRI和SamHI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5 oc ，
氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序；
7、将出现频率最多克隆的单个生长菌落所对应的DNA适配子和第10轮适
配子库各8ug分别加入含有107CFU的结核杆菌[ATCC93009(4)]菌液中感作，作
用方法同步骤5，感作后的细菌做小鼠(C57BL/6)攻毒实验，同时以没有处理 的结核杆菌做攻毒对照。将小鼠分为四组，每组8只。第一组为攻毒组，注射
107CFU H37RV/只；第二组将107CFU H37RV与第10轮ssDNA库8ug， 37。C感作30min
后再注射；第三组为第10轮出现频率最大适配子NK2与107CFU H37RV作用后注 射，方法同第二组；第四组为链霉素治疗组，注射l(/CFUH37RV后24h，再用链 霉素治疗(lmg/0.5ml.只/天)，共六天。同时取4只小鼠只注射筛选缓冲液(1>0 和0.05%Tween-80的生理盐水作为空白对照，所有小鼠均为尾静脉注射400ul。 实验前H37RV都经小鼠体内传代，以增强毒力，以便于结果稳定。
实验证明，适配子库和单适配子均能延长小鼠的生存时间，并能明显减少活 体肺组织的带菌量。因此，第十轮适配子库即为能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA 适配子库，其中出现频率最大的单适配子即为能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA 适配子。
上述SELEX筛选缓冲液(2X )为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl), 50mmol/L KC1, 200mmol/LNaCl， 0. 2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 5%甘油 (Glycerol), O.5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。
11SEQUENCE LISTING
<110〉武汉大学
<120〉抗结核杆菌感染的小分子核苷酸DNA适配子及其制备方法 <130〉抗结核杆菌感染的小分子核苷酸DNA适配子及其制备方法
<160〉 10
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 30
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 1
tttaatcaca caacaccgtg cttc犯gctt 30
<210〉 2
<211> 30
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400〉 2
tttaatcaca caacaccgtg tttc幼gctt 30
<210〉 3
<211〉 30
<212> 讓 <213>人工序列
<400〉 3
tttaatcaca caacaccgtg cttctagctt 30
〈210〉 4
〈211〉 30〈212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4
tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt
〈210〉 5 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 5
tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt
〈210〉 6 <211〉 30 <212〉 DNA
〈213〉人工序列 . 〈400〉 6
cgacaggggt ctgaatcacg tacattcgta
<210> 7 〈211〉 30 〈212> DNA <213>人工序列 <400> 7
cgacaggggt ctgaaccacg tacattcgta
<210> 8 <211〉 30 <212〉 腿
〈213〉人工序列〈400〉 8
ataactggat ccgtccacac cttc犯actg 30
<210〉 9 <211> 30 〈212〉 腿 <213〉人工序列 <400> 9
acccacttcg aatccagatt catgaaccaa 30
<210〉 10 〈211〉 30 <212> 腿 <213>人工序列 <400> 10
cccatactac attcatcccg gaacacgtgg 30
权利要求
1、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2、权利要求1所述的一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子在结核感染药 物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子及制备方法，DNA适配子具有SEQIDNO.1-10所示的核苷酸序列，其制备方法包括以下步骤首先是构建随机单链DNA文库的；其次是合成双链DNA文库；第三是SELEX筛选；第四是PCR扩增、第五是克隆和测序，第六是通过体内和体外实验证实DNA适配子的效果。该DNA适配子可直接作为结核杆菌拮抗剂使用，可用于预防和治疗结核病，克服临床常用药物利福平(rifampin)、链霉素(streptomycin)等治疗周期长，副作用大的缺点。
文档编号C12N15/11GK101497882SQ20091000399
公开日2009年8月5日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者章晓联, 凡 陈 申请人:武汉大学