专利名称：基于凝胶固定核酸的dna固定方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及将DNA固定于凝胶上的方法，该方法可用于制备DNA微阵列 以及固定DNA的反复利用等。本发明还涉及按照所述方法将DNA固定其上的 材料以及用所述材料检测靶核酸的方法。
背景技术：
由于持续的化学暴露(环境物质，食物等)，我们遗传物质的完整性时刻受 到挑战。在疾病过程以及人的一生中，基因组DNA并不是一成不变的，研究基 因组水平上的动态变化显得越来越有必要。
由于技术瓶颈的制约，对疾病过程中基因组水平上动态变化的系统性的比 对研究仍然无法进行。但是保存个体基因组DNA以供现在或者将来研究的需要， 显然具有极其重要的现实意义。如果能获得人一生基因组变化的信息并作为医 学资料保存下来，这必将能够推动对健康状态，疾病预测，疾病防治以及个性 化治疗的认识。然而，基因突变位点数量众多，从人体样本中获得基因组DNA 的产量受到限制，我们必须用有限的基因组DNA检测数以百万计的突变位点。 科研人员试图建立起高通量平台以实现检测的微型化，然而对所有可疑SNP位 点进行分析仍然需要大量的DNA样本。仅仅通过反应微型化技术似乎无法完成 这样的任务，基因组DNA固定化以实现DNA的回收和反复利用是一比较理想 的解决方法。
目前,固定DNA的已知方法大体分为以下两类丄DNA通过共价键与固相载 体相结合；2.DNA通过静电作用或者其它非共价键的形式与固相载体结合。显然，通过共价键结合的DNA具有更好的稳定性和可控性，是更合理的固定方法。为了提高与支持物的固定效率，需要预先热变性DNA，在未变性的情况下固定效率明显降低。另外，在现有技术中，为了对固定着的DNA进行分析，往往需要通过PCR方法对目的片段进行扩增。因此，这种DNA的固定方法需要耐受反复重复的热循环
(1) 将样品温度增加至95 °C，解开DNA双链中的氢键；
(2) 将样品温度降低至45 °C，使得DNA模板与引物杂交，便于后续的DNA扩增；
(3) 将样品温度增加至74 °C，通过使用聚合酶延伸引物实现DNA的体外扩增。
发明内容
本发明提供了一种基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，由本发明制备得到的固定有DNA的凝胶能够承受反复的PCR反应条件，为DNA的反复使用提供了可能。
本发明所述的DNA样本的固定方法，包括原料选择、混合和聚合反应三个步骤；各步骤的内容如下-.
原料选择选用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯酰胺储存液10—70 %;稀释变性氨基未端修饰的核酸1 nL—5ml;N,N,N,N-四甲基乙二胺1—10%; 10%过硫酸铵1—10%; 其余为水；
混合在配置好的凝胶原料中加入氨基末端修饰的核酸进行混合，混合物
中含有的核酸量为10-1000ng/3pL;
聚合反应取5 ^L混合物置于PCR反应管中，37"C放置30分钟待聚合反应结束后，混合物成型成凝胶状，末端氨基修饰的核酸即通过共聚反应在凝胶中得以固定。
本发明与现有技术相比具有以下优点采用的固相载体，甲基丙烯酰胺单体/甲叉双丙烯酰胺水凝胶的三维结构确保了 DNA结合的高承载量，同时水凝胶的亲水特性能为固定的DNA创造良好的溶液环境便于随后PCR反应的进行。末端修饰的核酸分子通过与固相载体之间形成稳定的共价键实现固定，能够经受PCR反应的剧烈条件，为随后的PCR反应验证提供了保证。这种新型的DNA共聚反应在没有UV激发的情况下，仍然有较高的固定效率，从而排除了共聚反应中生成嘧啶二聚体的可能性，对SNP检测以及基因组测序尤为重要。
图1是甲基丙烯酰胺单体/甲叉双丙烯酰胺水凝胶固定末端氨基修饰的PCR产物的固定效果图。
图2是5'末端带有氨基的PCR产物作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图。
图3是pUCm-T-SEE质粒断裂片断作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图。
图4是人基因组DNA断裂片断作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图。
具体实施方法
技术领域：
本发明所述的DNA样本的固定方法，包括原料选择、混合和聚合反应三个步骤；各步骤的内容如下
原料选择选用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯
酰胺储存液！0—70 % ，稀释变性氨基未端修饰的核酸1 HL—5ml;N,N，N，N-
四甲基乙二胺1—10%; 10%过硫酸铵1—10%;其余为水；混合在配置好的凝胶原料中加入氨基末端修饰的核酸进行混合，混合物中含有的核酸量为10-1000ng/3|iL;
聚合反应取5 ^L混合物置于PCR反应管中，37'C放置30分钟待聚合反应结束后，混合物成型成凝胶状，末端氨基修饰的核酸即通过共聚反应在凝胶中得以固定。
所述甲基丙烯酰胺单体重量浓度在5% - 30%之间，N,N,N,N-四甲基乙二胺
重量浓度在4%，过硫酸胺重量浓度在6%。核酸的浓度在0.5pg/mL - 50pg/mL
用5%和20%聚甲基丙烯酰胺凝胶原料配制DNA样本的配方表
原料名称 20%聚甲基丙烯酰胺凝胶 5%聚甲基丙烯酰胺凝胶
10xTBE (pH13) 3 pL 3
40。/。甲基丙烯酰胺储存液 15 nL 4pL
H20 6jiL 17 pL
稀释变性的氨基未端修 3&饰的核酸
N,N，N,N-四甲基乙二胺 1.2 nL 1.2 pL
10%AP (过硫酸铵) 1.8 HL 1.8
参照图1:本发明所述甲基丙烯酰胺单体/甲叉双丙烯酰胺水凝胶固定末端氨基修饰的PCR产物的固定效果(其中泳道l: pH11.0;泳道2: pH7.0)。
参照图2: 5'末端带有氨基的PCR产物作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图；其中泳道l (40次PCR反应后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.6序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；泳道2(80次PCR反应后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.7序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；泳道3 (120次PCR反应后)SEQIDN0.4和SEQIDNO,8序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；泳道4(160次PCR反应后)SEQIDN0.3和SEQIDN0.6序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物。参照图3: pUCm-T-SEE质粒断裂片断作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图；其中泳道l (40次PCR反应后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.6序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；泳道2(80次PCR反应后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.8序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；泳道3 (120次PCR反应后)SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.6序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物。
参照图4:人基因组DNA断裂片断作为固定模板进行PCR扩增后的琼脂糖电泳图；其中泳道l (50次PCR反应后)SEQIDNO.9和SEQIDNO.10序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物；其中泳道2 (100次PCR反应后)SEQIDNO.il和SEQ ID NO. 12序列号的引物对PCR扩增后的PCR产物。实施例1
水凝胶共聚化学固定DNA效率的检测
(1) 末端修饰的PCR扩增产物的制备
将包含金黄色葡萄球菌肠毒素E基因的质粒DNA (pUCm-T-SEE,其中see的GenBank登录号M21319)作为模板，通过PCR扩增该基因约850 bp的片段。用于此PCR的两种引物的碱基序列见SEQIDNO.l和SEQIDNO.2;在引物合成过程中，在上下游引物的5'末端引入了(CH2)6-NH2修饰；PCR反应结束后，回收PCR产物后，GeneQuant定量分析，-20 "C保存待用；
(2) 取5%聚甲基丙烯酰胺凝胶和20%聚甲基丙烯酰胺凝胶液待用；按照下列配方配置凝胶
5%聚甲基丙烯酰胺凝胶20%聚甲基丙烯酰胺凝胶H20 3.167 mL —
10xTBE (pH13) — 3nL
5xTBE (pH8.3) 1 mL —
Acrylamide/Bis储存液(30%) 0.833 mL —
40%甲基丙烯酰胺溶液 一 15 nL
PCR产物 一 9 nL
TEMED 2.5 1.2
10%AP (过硫酸铵) 25 nL 1.8(3)安装垂直板型电泳装置，将所配置的5%聚甲基丙烯酰胺凝胶和20%聚甲 基丙烯酰胺凝胶液分别沿着凝胶的长玻璃片的内侧用移液器加至长短玻璃片的 窄缝内直至凝胶液溢出，轻轻地将梳子插入凝胶内；放置lh后小心拔去梳子， 用滤纸条吸去残留的液体；将制备好的含有PCR产物的30 pL凝胶注入凹槽，37 'C烘箱内放置lh，直至聚合反应结束；将500mL电泳缓冲液(lxTBE)倒入电 泳槽中，合上电泳槽，设置电泳时间和电压；160V电泳60min;电泳结束后， 带上手套，小心从制胶板上将凝胶剥下，清水洗胶，将胶放入EB染色液中缓慢 摇动，染色20-30min，小心不要将胶撕破；取出用水漂洗后，UV下拍照记录。 实施例2
固定方法的热稳定性实验
(1) 末端修饰的PCR扩增产物的制备
将包含金黄色葡萄球菌肠毒素E基因的质粒DNA (pUCm-T-SEE，其中see 的GenBank登录号M21319)作为模板，通过PCR扩增该基因约850 bp的片段； 用于此PCR的两种引物的碱基序列见SEQIDNO.l和SEQIDN0.2;在引物合 成过程中，在上下游引物的5，末端引入了(CH2)6-NH2修饰；PCR反应结束后，回 收PCR产物后，GeneQuant定量分析，-20 。C保存待用；
(2) PCR产物的固定
取之前扩增、纯化后的PCR产物(末端带有NH2修饰)，取lpL用双蒸水稀 释到10ng-l吗/nL;取稀释后的PCR产物，100 。C加热变性5 min后立即置于冰浴 内；按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝胶
聚甲基丙烯酰胺凝胶
10xTBE (pH13)
40%甲基丙烯酰胺储存液 H20
稀释变性的PCR产物 TEMED
10%AP (过硫酸铵)
3pL (末端NH2修饰)
1.2 nL 1.8 nL
3pL 15
6nL制备好的凝胶均分成3分注入PCR反应管中，37 ""C烘箱内放置0.5h，待凝胶 聚合成型。用ixTAE配制1.5X的琼脂糖凝胶，取聚合反应完的甲基丙烯酰胺凝 胶，放置于琼脂糖凝胶的孔洞中。电泳缓冲液为lxTAE，电压为120V，电泳45 min，去除吸附于凝胶内部和表面的PCR产物。2mL双蒸水振荡洗涤凝胶3次后， 吸去凝胶表面水滴，作为模板运用于随后的PCR反应中。
(3)以固定的PCR产物为模板进行PCR扩增
根据固定的PCR产物的序列信息，设计以下3对上下游引物SEQIDNO，3 -SEQIDNO.8;通过不同配伍，逐渐延伸所获得的PCR产物，排除每次PCR反应 后残留PCR产物的影响；在每次PCR反应结束以后，对反应液进行琼脂糖凝胶电 泳，观察是否有预期的特异性条带生成，如果有则证明该次PCR反应之前在凝胶 中仍然有模板DNA的存在，以PCR反应的成功次数来表征该方法的耐热效果。 实施例3
pUCm-T-SEE质粒片段的固定
(1) pUCm-T-SEE的断裂以及末端修饰 按照常规方法提取pUCm-T-SEE质粒，取纯化后的pUCm-T-SEE质粒100 pL， 加入甲酸50pL，混匀后置于30 'C水浴中反应，反应时间由20min;反应结束 后立即加入NaOH乳浊液调整pH至7.0;按照试剂盒说明书要求，使用DNA胶回 收试剂盒回收经过甲酸处理后的质粒DNA，用100 pL双蒸水回收柱上的DNA， 离心管中的液体即为回收的质粒DNA;向脱嘌呤的质粒溶液中加入25 ^L2.5 mol'L"的乙二胺盐酸盐溶液，混匀后加入NaOH乳浊液调整pH至7.4， 37 'C水浴 中反应4h; 4h后加入25pL新配的0.1mol七"的硼氢化钠溶液，室温放置l h。最 后加入15pL的20%的乙二胺盐酸盐溶液，室温放置lh，结束反应；反应结束 后，按照DNA回收试剂盒说明书要求，回收质粒DNA片段，琼脂糖电泳检测反应结果后，-20 "C保存待用；
(2) pUCm-T-SEE片段的固定及热稳定性实验
将纯化得到的带有末端氨基的pUCm-T-SEE质粒片段电泳检测，选取分子大
小〈850bp的质粒片段进行割胶回收，得到的终溶液用GeneQuant定量，稀释到一
定浓度，PCR反应验证模板DNA的存在后，置于-20 "C保存。
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝胶
聚甲基丙烯酰胺凝胶
10xTBE (pH13) 3
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6nL
稀释的变性pUCm-T-SEE质粒片段 3
TEMED 1.2^
10%AP (过硫酸铵) 1.8 jiL
制备好的凝胶分装3分注入PCR反应管中，37 "C烘箱内放置lh，待凝胶聚 合成型。按照之前方法使用不同引物的配伍进行PCR反应，检测化学方法的热稳 定性，并将部分PCR产物送检测序。 实施例4
人基因组DNA的固定化
(1) 人基因组DNA的提取
按照说明书的要求，提取人基因组DNA，使用GeneQuant定量；
(2) 人基因组DNA的断裂以及末端修饰
取纯化后的人基因组DNA100pL，加入甲酸50pL，混匀后置于30 "C水浴 中反应，反应时间5min。反应结束后立即加入NaOH乳浊液调整pH至7.0;按照 试剂盒说明书要求，使用DNA胶回收试剂盒回收经过甲酸处理后的人基因组 DNA，最后用100pL双蒸水回收柱上的DNA，离心管中的液体即为回收的人基 因组DNA;向液体中加入25nL2.5mol丄"的乙二胺盐酸盐溶液，混匀后加入 NaOH乳浊液调整pH至7.4， 37 。C水浴中反应4h; 4h后加入25nL新配的0.1mol.L"的硼氢化钠溶液，室温放置lh;最后加入15pL的20%的乙二胺盐酸
盐溶液，室温放置lh，结束反应；反应结束后，按照DNA回收试剂盒说明书要
求，反复多次回收人基因组DNA片段，PCR反应验证基因组DNA的完整程度，
-20 'C保存待用；
(3)人基因组DNA片段的固定及热稳定性实验
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝胶
聚甲基丙烯酰胺凝胶
10xTBE (pH13) 3 nL
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6 |xL
人基因组DNA片段 3pL
TEMED 1.2
10%AP (过硫酸铵) 1,8 jiL
制备好的凝胶分装3分注入PCR反应管中，37 'C烘箱内放置lh，待凝胶聚 合成型；使用以下引物反复进行PCR检测，检测化学方法的热稳定性。
权利要求
1. 一种基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，其特征是包括原料选择、混合和聚合反应三个步骤；各步骤的内容如下原料选择选用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺储存液10—70％；稀释变性氨基未端修饰的核酸1μL—5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1—10％；10％过硫酸铵1—10％；其余为水；混合在配置好的凝胶原料中加入氨基末端修饰的核酸进行混合，混合物中含有的核酸量为10-1000ng/3μL；聚合反应取5μL混合物置于PCR反应管中，37℃放置30分钟待聚合反应结束后，混合物成型成凝胶状，末端氨基修饰的核酸即通过共聚反应在凝胶中得以固定。
2、 根据权利要求1所述的基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述甲基丙烯酰胺单体重量浓度在5% - 30%之间，N,N,N，N-四甲基乙二胺重 量浓度在4%，过硫酸胺重量浓度在6%;核酸的浓度在0.5pg/mL-5(Hig/mL。
3、 根据权利要求1所述的基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述混合物的pH值的范围在7.0-11.0之间，且随着pH值的增高，DNA的固定效率具有明显的上升趋势。
4、 根据权利要求1所述的基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的核酸是末端氨基的寡聚核苷酸、末端氨基修饰的PCR产物或末端氨基 修饰的长链DNA分子中的一种；当待固定的核酸是质粒、基因组等长链DNA 分子时，需要采用将其长链断裂成100bp-100Kb的D NA碎片，并在其3'或5' 末端引入活性氨基便于后续的固定。
5、 根据权利要求4所述的基于凝胶固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的长链DNA采用甲酸处理DNA生成活性醛基，该活性醛基随后与乙二 胺和硼氢化钠反应随机断裂长链DNA，并在断裂片断的3'末端引入了活性氨基。
全文摘要
本发明涉及将DNA固定于凝胶上的方法，特别是涉及一种基于凝胶固定核酸的DNA固定方法及其应用；所述的DNA样本的固定方法包括原料选择、混合和聚合反应三个步骤；各步骤的内容如下原料选择选用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺储存液10-70％；稀释变性氨基末端修饰的核酸1μL-5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1-10％；10％过硫酸铵1-10％；其余为水；混合在配置好的凝胶原料中加入氨基末端修饰的核酸进行混合，混合物中含有的核酸量为10-1000ng/3μL；聚合反应取5μL混合物置于PCR反应管中，37℃放置30分钟待聚合反应结束后，混合物成型成凝胶状，末端氨基修饰的核酸即通过共聚反应在凝胶中得以固定；本发明具有承载量高、末端修饰的核酸分子通过与固相载体之间形成稳定的共价键实现固定，能够经受PCR反应的剧烈条件等优点。
文档编号C12Q1/68GK101481733SQ20091000398
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月4日
发明者厉朝龙, 贾丹梅 申请人:杭州恩氏基因技术发展有限公司