食品中乳酸产生细菌的检测和定量的制作方法
【专利摘要】使用实时PCR快速检测和/或定量乳酸菌的方法和试剂盒，其包括第一条引物、第二条引物和探针。引物和探针的每一种与乳酸菌的16SrRNA基因的不同区域互补。所述方法和试剂盒可以用于检测和/或定量食物如酸奶中的乳酸菌（以支持产品标记）和萨尔萨辣酱中的乳酸菌。
【专利说明】食品中乳酸产生细菌的检测和定量
[0001]优先权
本申请要求享受于2011年6月27日提交的标题为“食品中乳酸产生细菌的检测和定量”的美国临时专利申请号61/501，470的优先权，其整体内容通过引用并入本文。
[0002]背景
产生乳酸作为碳水化合物代谢的终产物的细菌群称为乳酸菌。这些细菌可见于自然界中，如在腐烂的植物中，以及在某些食品，如酸奶中。它们包括例如属:乳杆菌氣 iLactobaciIlus、、明串珠菌雇i (Zeuconostoc')、片球菌 M^Pediococcus\ 乳球菌属(Xactococcus、、链球菌属(Streptococcus')、气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobac teria? )、肠球菌属(Mn terococcus )、酒球菌属(Oenococcus )、芽胞乳杆菌属{SporolactobaciIlus )、四联球菌属(Jerageiiococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Zfei1SdJa)的细菌。
[0003]乳酸菌用于生产酸奶，其中所述细菌产生对产品的特有风味有贡献的乳酸。根据酸奶的生产方法，活的乳酸菌可以存在于最终的酸奶产品中。此类活细菌的存在经常被认为是酸奶中想要的特征。例如，酸奶中活乳酸菌的存在与某些健康和消化益处相关联。乳酸菌将乳中的乳糖发酵，使得具有乳糖不耐受的个体更易于消化酸奶。消费者还将其他健康益处与酸奶中活的且有活性的乳酸菌培养物的存在相关联。因而认为在酸奶中存在活的乳酸菌是想要的并且被一些消费者所优选。
[0004]National Yogurt Association (N.Y.A.)要求，在制造时酸奶具有高于某一浓度的有活性的乳酸菌培养物并且在储存期结束时进行的活性测试过程中细菌的总数增加一个对数，以用说明产品含有活的且有活性的培养物的封条来标记。Food and DrugAssociation (F.D.A.)已经提出了这样的规定,其同样要求在制造时和在储存期结束时酸奶中存在某一最小量的细菌，以将产品标记为包括活的且有活性的乳酸菌培养物。因而期望定量酸奶中存在的活的乳酸菌，以支持此类标记。
[0005]在其他食品中，可能不期望存在高水平的乳酸菌。例如，食品中，如萨尔萨辣酱(salsa)产品和熟食类型的(deli style)肉片中乳酸菌的过度生长可以引起令人讨厌的产品质量下降并可以在食品上产生粘层。尽管此类细菌的过度生长对消费者无害，但它却引不起食欲。因而，期望在将此类产品投放到市场之前或在此类产品成分进一步加工之前定量乳酸菌。例如，如果所述产品成分，如用于制备萨尔萨辣酱的蔬菜具有令人难以接受的高水平的细菌，那么可以丢弃这些成分，从而不使用这些成分制备产品。这样，在最终将具有令人难以接受的高水平细菌的产品生产和包装中不会消耗额外投资。熟食类型的肉产品在制造过程中是经过卫生处理的并且在真空或改良的大气中进行包装的；如果此类产品储存于10°C以下，那么期望它们能够维持高感官品质2-4周。然而，由乳酸菌引起的酸败有时候在储存期内发生，这需要生产者进行召回。重要的是能够检测熟食肉产品中的乳酸菌并降低损失和产品召回。
[0006]传统上，已经使用选择性培养基如酸化的MRS (de Man, Rogosa和Sharpe)琼脂检测并定量食品中的乳酸菌。然而，此类方法耗时，细菌生长需要若干天以达到细菌菌落在培养基平板上可见的足够程度。这种方法称为平板培养，尽管有用，但却在获得结果前需要大量的工作并且延迟。在这段时间里，食物成分或产品在进行进一步加工或投放到市场之前可能要先保持。因而，期望开发定量食品中的乳酸菌的快速方法，来降低加工和产品投放的延迟。
[0007]更快速的方法使用Bactometer来检测乳酸菌。Bactometer可以用于检测食品如沙拉酱和用于萨尔萨辣酱生产的食物成分如切碎的蔬菜中的乳杆菌(Iactobacilli)。方法可以包括产品在含有对乳杆菌具有选择性的培养基的模块孔中在30± 1°C下孵育24 土I小时。然后将所述模块置于Bactometer系统中，并将菌落计数与检测时间相关联。如果在模块孔中检测到任何生长，那么可以将材料划线到琼脂平板上，其中在选择性培养基上生长后可以进一步鉴定所述菌落。然而，Bactometer通过测量由细菌生长引起的具体物理化学变化来定量细菌。因为直至生长出现才可以检测细菌，所以该方法也是耗时的。此外，一些细菌尽管是活的，但却不可以在所用的培养基中生长。这些细菌称为活而非可培养(VBNC)细菌，并且不能通过Bactometer或培养方法进行检测。因而，期望开发定量食品中的总乳酸菌的快速且不依赖于培养的方法。
[0008]用于检测细菌核酸的一种不依赖于培养的技术是聚合酶链反应的方法，通常称为PCR，其一般被认为是用于检测给定样品中的核酸的最灵敏和最快速的方法。为了进行PCR，需要与细菌的核酸互补的一对寡核苷酸序列作为引物。一条引物与目标细菌核酸序列的5’端的细菌核酸互补，而另一条引物与目标核酸序列的3’端的细菌核酸互补。对于实时PCR(RT-PCR)的技术，使用这样的探针，其也与两条引物之间的目标细菌核酸序列互补，允许检测和定量目标材料。
[0009]尽管已知实时PCR的技术可以用于检测和定量目标核酸序列，但是它们依赖于鉴定独特序列，以充当引物和探针，并且这种鉴定可能是有挑战性的。此类序列必须不仅对目标材料独特，而且还不能与其自身结合来形成引物二聚体。所述探针还应该满足设计指导方针，包括在探针的5’端不具有鸟嘌呤残基；具有适当的Tm值(解链温度);尽可能地短，但至少具有13个核苷酸；不具有相同核苷酸串(runs of identical nucleotides);及其他特征。因而，鉴定满足对于提高实时PCR的成功可能性所必需的这些指导方针的第一条和第二条引物序列以及探针序列可能是困难的。
[0010]概述
本发明的实施方案允许使用实时PCR的技术快速且特异性检测和定量乳酸菌。
[0011]实施方案还包括用于检测乳酸菌的试剂盒，其包括第一条引物序列、第二条引物序列，和探针序列，其中每条序列与乳酸产生细菌的16S rRNA基因的不同区域互补。例如，在一些实施方案中，第一条和第二条引物序列和探针序列的每一种与SEQ.1D.N0.4的不同区域互补。
[0012]在一些实施方案中，用于PCR检测乳酸菌的试剂盒包括:包含SEQ.1D.N0.1的第一条引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二条引物，和包含SEQ.1D.N0.3的探针。
[0013]在一些实施方案中，探针包括荧光团，如羧基荧光素。在一些实施方案中，试剂盒还包括膜不透性染料。
[0014] 在其他实施方案中，本发明包括检测样品中乳酸菌的方法，其包括将样品稀释，将样品离心以产生沉淀，使用沉淀进行细菌DNA的提取，将所提取的细菌DNA与包含以下的PCR试剂组合:包含SEQ.1D.N0.1的第一条引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二条引物、包含SEQ.1D.N0.3的探针、DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸，使组合的提取DNA与PCR试剂通过热循环仪循环，并获得对应于通过热循环仪检测到的信号的数据。所述方法还可以包括将对应于所检测到的信号的数据与标准曲线进行比较，以定量样品中存在的乳酸产生细菌的量。在一些实施方案中，所述样品是食物样品，如酸奶。在一些实施方案中，探针包括荧光团，如羧基荧光素。
[0015]附图
图1是根据本发明的实施方案检测乳酸菌的方法的流程图；
图2是酸奶产品的实时PCR结果；
图3是酸奶产品中乳酸菌相对于使用图2中所示的PCR结果产生的Ct的标准曲线； 图4a是萨尔萨辣酱蔬菜的实时PCR结果；
图4b是萨尔萨辣酱蔬菜的实时PCR结果；
图4c是萨尔萨辣酱蔬菜的实时PCR结果；
图5a是细菌浓度相对于图4a所示的萨尔萨辣酱蔬菜的Ct的标准曲线；
图5b是细菌浓度相对于使用图4b所示的PCR结果的萨尔萨辣酱蔬菜的Ct的标准曲线；和
图5c是细菌浓度相对于使用图4c所示的PCR结果的萨尔萨辣酱蔬菜的Ct的标准曲线。
[0016]详细描述
现在已经发现，可以使用实时PCR鉴定乳酸菌。这些乳酸菌可以使用对这些细菌特异的一对引物序列使用PCR技术进行选择性地扩增，然后可以使用也对这些细菌特异的探针进行鉴定。本发明的实施方案可用于快速检测和定量食品中的乳酸产生细菌。示例性食品例如包括酸奶产品、蔬菜如用于萨尔萨辣酱生产的蔬菜和腌黄瓜、熟食类型的肉产品、沙拉酱、番茄酱、乳制品如乳酪、鱼产品如鲱鱼、酒、啤酒、柠檬水、果汁和花蜜(nectars)。本发明的实施方案还可以用于环境测试，如测试食品生产设备。
[0017]在酸奶中发现为活的且有活性的培养物的乳酸菌包括嗜热链球菌{Streptococcus thermophiIus)> 德氏乳杆菌保加利亚亚砍(XactobaciIIusdelbrueckii subspecies buIgaricuS、和德氏乳杆菌乳酸亚种{Lactobacillusdelbruickii subspecies lactis)0当实时定量PCR的技术应用于酸奶样品时,可以快速并准确地确定这些细菌的菌落形成单位的浓度(如每克酸奶的CFU)。如此，本发明的方法可以用于在特定时间，如在生产完成时(以支持标记所述酸奶产品含有活的且有活性的培养物)或在储存期结束时，定量酸奶产品中存在的活乳酸菌的数量。
[0018]或者，本发明的实施方案可以用于定量蔬菜，如用于生产萨尔萨辣酱或其他食品的蔬菜中存在的乳酸产生细菌的水平。例如在萨尔萨辣酱生产过程中，首先将蔬菜切碎，然后与糖和盐及其他成分混合，然后置于容器如罐或玻璃瓶中，并且在最后进行加热，以进行巴氏灭菌来杀死潜在的病原体。这些蔬菜可以包括番茄、洋葱、辣椒、玉米、芫荽等。监测萨尔萨辣酱成分质量的一种方式是在巴氏灭菌之前定量蔬菜中存在的乳酸菌。如果蔬菜具有大于阈值量的乳酸菌，那么在加工过程中可能不会杀死足够量的乳酸菌，从而终产品可能会被乳酸菌破坏，降低储存期和产品质量。此类蔬菜可以丢弃并且不可以用于萨尔萨辣酱生产。相反，如果蔬菜含有小于阈值数的乳酸菌，那么可认为进一步的加工步骤足以使最终的萨尔萨辣酱产品在正常储存期内不被乳酸菌破坏。在一些实施方案中，用于萨尔萨辣酱生产的切碎的蔬菜中的阈值是IO5 Cfu/克，而在其他实施方案中，阈值是IO6 Cfu/克。
[0019]在其他实施方案中，方法和试剂盒用于检测和定量沙拉酱中的乳酸菌。基本的检测步骤与蔬菜的检测定量相似，包括样品制备、DNA分离和RT-PCR反应。
[0020]在仍其他实施方案中，所述方法和试剂盒用于检测和定量熟食类型的肉中的乳酸菌。可以用于本发明实施方案的熟食类型的肉的实例包括火鸡、火腿、烤牛肉、意大利腊肠、鸡肉等。为了避免这种情况，可以根据本发明的实施方案测试熟食肉，以检测和定量如最终熟食肉产品中的乳酸菌。
[0021]本发明的实施方案使用一对寡核苷酸引物和探针，设计其每一种以特异性靶向乳酸菌。引物对包括与位于目标核酸序列的5’端的序列互补的正向或上游引物和与位于目标核酸目标的序列的3’端的序列互补的反向或下游引物。所述目标核酸序列对乳酸菌是独特的，并且允许将所检测的细菌特异地鉴定为乳酸菌。此外，引物对和探针对目标核酸序列是特异的，从而它们不结合任何其他细菌的核酸。
[0022]用于本发明实施方案的引物包括下文所示的SEQ ID Nos.1和2。上文示为SEQID.N0.1的引物是正向或上游引物。鉴定为SEQ ID.N0.2的引物是反向或下游引物。用于本发明实施方案的探针在下文示为SEQ ID.N0.3。在一些实施方案中，鉴定为SEQ ID.N0.3的探针是在其5’端具有荧光团并且在其3’端具有猝灭剂的TaqMan?探针。
【权利要求】
1.用于PCR检测乳酸菌的试剂盒，其包含: 包含SEQ.1D.N0.1的第一条引物； 包含SEQ.1D.N0.2的第二条引物；和 包含SEQ.1D.N0.3的探针。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述探针进一步包含荧光团。
3.权利要求2的试剂盒，其中所述荧光团包含羧基荧光素。
4.权利要求2的试剂盒，其进一步包含膜不透性染料。
5.用于检测乳酸产生细菌的试剂盒，其包含: 与SEQ.1D.N0.4的第一个区域互补的第一条引物； 与SEQ.1D.N0.4的第二个区域互补的第二条引物； 与SEQ.1D.N0.4的第三个区域互补的探针。
6.权利要求5的试剂盒，其中所述第一条引物包含SEQ.1D.N0.1。
7.权利要求5的试剂盒，其中所述第二条引物包含SEQ.1D.N0.2。
8.权利要求5的试剂盒，其中所述探针包含SEQ.1D.N0.3。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述探针进一步包含荧光团。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述荧光团包含羧基荧光素。
11.用于PCR检测乳酸产生细菌的试剂盒，其包含: 与乳酸菌的16S rRNA基因的第一个区域互补的第一条引物； 与乳酸菌的16S rRNA基因的第二个区域互补的第二条引物； 与乳酸菌的16S rRNA基因的第三个区域互补并且标记有荧光团的探针。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述第一条引物包含SEQ.1D.N0.1。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述第二条引物包含SEQ.1D.N0.2。
14.权利要求11的试剂盒，其中所述探针包含SEQ.1D.N0.3。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述探针进一步包含荧光团。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述荧光团包含羧基荧光素。
17.检测样品中乳酸菌的方法，其包括: 制备所述样品； 使用制备的样品进行细菌DNA提取，以获得提取的细菌DNA ； 将所述提取的细菌DNA与PCR试剂组合，所述PCR试剂包含含有SEQ.1D.N0.1的第一条引物、含有SEQ.1D.N0.2的第二条引物、含有SEQ.1D.N0.3的探针、DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸； 使组合后的提取的DNA与PCR试剂通过热循环仪循环；和 获得对应于通过所述热循环仪检测到的信号的数据。
18.权利要求17的方法，其进一步包括将所述对应于检测到的信号的数据与标准曲线进行比较，以定量所述样品中存在的乳酸产生细菌的量。
19.权利要求18的方法，其中食物样品包含酸奶。
20.权利要求17的方法，其中所述探针进一步包含荧光团。
21.权利要求20的方法，其中所述荧光团包含羧基荧光素。
【文档编号】C12Q1/68GK103930564SQ201280041709
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年6月27日
【发明者】Y.胡, M.C.墨菲, K.斯蒂芬斯 申请人:通用工厂公司