专利名称：细菌发酵生产l－乳酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，尤其涉及发酵生产有机酸的领域。更具体地说，本发明涉及一种用嗜热性乳酸杆菌发酵生产L-乳酸的方法。
目前，国内发酵生产L-乳酸的技术全部都是用根霉发酵。但是，根霉发酵存在许多缺点。首先，根霉发酵需要通入无菌空气，因此就要求增加空气系统，而且对于发酵罐的设备要求也较高(通常要用耐温耐压的不锈钢)，电和蒸汽的消耗量也就增大；其次，根霉发酵对糖的转化率较低，均在70～80％之间；第三，根霉发酵一般用淀粉作为原料，因而原料成本增加；第四，根霉发酵温度均在30～35℃左右，对无菌操作的要求非常严格，操作不慎则容易染菌。染细菌会降低L-乳酸的纯度；染酵母会产生大量乙醇而产酸很低；染霉菌会产生大量富马酸而造成倒罐报废。综上所述，目前的根霉发酵生产L-乳酸的工艺仍存在着投资成本和生产成本较高以及可操作性较差的缺点。
除了用霉菌发酵生产L-乳酸外，国外还有许多人尝试用细菌来厌氧发酵生产L-乳酸，以避免采用空气系统带来的生产成本较高的问题。例如，中国专利申请96121927.0公开了用凝结芽胞杆菌来发酵生产L-乳酸，但是该菌是一种营养缺陷型菌，对培养基的要求较高。
另外，乳酸杆菌也能生产L-乳酸。目前已知能产L-乳酸的乳酸杆菌有很多种，包括野生乳杆菌、纤毛乳杆菌、干酪乳杆菌、蔗糖乳杆菌、凝固乳杆菌、奥拉金森小杆菌等。但是，还没有人报道用乳酸杆菌来厌氧发酵生产L-乳酸。因为这些乳酸杆菌存在一个普遍的问题，即它们的发酵温度与产D型和D/L型的德氏乳酸杆菌的发酵温度接近，因此在发酵时非常容易混入产D型乳酸的德氏乳酸杆菌，从而导致发酵产生的L-乳酸的纯度降低。
因此，本发明的目的是一种新的发酵生产高纯度L-乳酸的方法。
本发明涉及一种新的发酵生产高纯度L-乳酸的方法，该方法包括用产L-乳酸的嗜热性乳酸杆菌在高温下厌氧发酵来生产L-乳酸。本发明另一个较佳的实例是在发酵温度为52℃至58℃，更佳的发酵温度为52℃-54℃。
本文所述的产L-乳酸的嗜热性乳酸杆菌例如可用以下方法获得以发芽麦粒为原料，在液体增殖培养基中高温(例如52-58℃)下厌气培养数天，收集获得产酸在7.0％以上、对糖转化率高于90％、L-乳酸纯度高于95％的菌株。另外还可对生产菌进行紫外诱变和化学诱变，以筛选出产L-乳酸纯度更高、性能更佳的菌株。这些诱变技术均是本领域技术人员所熟知的。
本文中列举的具体例子是嗜热性乳酸杆菌(Lactobacillus thermophilus)Lt616，但是本领域技术人员应当理解，本发明的范围并不局限于嗜热性乳酸杆菌Lt616，所有能在高于52℃的温度下发酵产生L-乳酸的乳酸杆菌均在本发明的思路和范围中。
本发明采用厌氧发酵。本文所用的术语“高温”是指发酵温度高于德氏乳酸杆菌存活的温度，较佳的在52-58℃之间，更佳的在52-54℃之间。发酵培养基可含有常用于微生物培养的碳源、氮源和其它营养源。例如碳源可以选自麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、甘油等；氮源可以是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、大豆粉、玉米浆等；其它营养源可选自磷酸盐、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙。培养基的pH在5.5-6.5之间。
对于发酵液总糖，可采用费林式法进行测定。对于发酵液总酸，则可用E.D.T.A法测出乳酸盖含量再换算成乳酸量。
本文所用的术语“高纯度”是指L-乳酸的纯度至少为95％，更佳的在97％以上。L-乳酸的纯度可用纸上层析法测定，也可以用乳酸-葡萄糖分析仪或高压液相色谱法来测定，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。
本发明利用嗜热性乳酸杆菌厌氧发酵生产L-乳酸的方法不仅不必象根霉发酵那样有较高的投资成本和生产成本，而且更重要的是，该发酵工艺通过利用高温条件抑制了产D型乳酸的德氏乳酸杆菌的生长，从而使得发酵产物的L-乳酸纯度高于95％。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。
实施例1嗜热性乳酸杆菌的筛选a)培养基组成下面提供了用于筛选以及发酵的培养基的组成，其中培养基组分用％(重量)表示，所有试剂均为化学纯。
分离培养基1(％)麦芽糖6，牛肉膏0.15，蛋白胨0.1，磷酸氢二钾0.05，磷酸二氢钾0.04，硫酸镁0.04，氯化钠0.02，碳酸钙7，琼脂4，蒸馏水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa灭菌20分钟。
分离培养基2(％)葡萄糖1，牛肉膏0.05，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，吐温80 0.05，碳酸钙7，琼脂4，蒸馏水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa灭菌20分钟。
斜面培养基(％)麦芽糖6，牛肉膏0.3，蛋白胨0.2，酵母膏0.3，磷酸氢二钾0.05，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05，氯化钠0.02，碳酸钙5，琼脂3，蒸馏水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa灭菌15分钟。
液体增殖培养基(％)麦芽糖4，牛肉膏0.3，蛋白胨0.2，酵母膏0.25，磷酸氢二钾0.05，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05，氯化钠0.05，碳酸钙5，蒸馏水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa灭菌10分钟。
种子培养基8％玉米粉、5％米糠。玉米粉、米糠产地为山东省邹平。
发酵培养基12％玉米粉、3％米糠。玉米粉、米糠产地为山东省邹平。
b)嗜热性乳酸杆菌的筛选取两种供试验分离的样品发芽麦粒0.5～1克分别投入装有液体增殖培养基的两支试管内，加塞，于50±1℃培养二天。取出测酸，挑出试管液面不生膜、产酸在3.5％以上的试管样品，然后在分离培养基1上做平板划线分离，在厌气条件下培养三天。选择其中透明圈大的菌落，重复接入液体增殖培养基内培养二天，测定产酸在4.0以上，纸上层析中与标准对照(美国Sigma公司结晶乳酸稀释成2％的乳酸)相同的菌株为标准，共获得364株。
将364株分别接入液体增殖培养基内，加塞在厌气条件下58±1℃培养三天，在显微镜下观察菌体的外观形态为粗壮稍弯直长杆状，不规则，少见分段。杆状大小0.9～1.0×7～13μm。液面特征不产膜，生成轮圈。以此为标准共获得56株。
重复上述操作，并将所获得菌株分别移入种子培养基中，在53±1℃、pH5.5～6.5下培养24～36小时，接入发酵培养基内，接种量为10％。在52±1℃，pH5.5～6.5下培养四天，每天流加灭过菌的碳酸钙中和生成的乳酸。收集产酸在7.0％以上、对糖转化率不低于90％、L-乳酸纯度不低于70％的菌株，获得26株。
先在分离培养基2上涂布分离，在53±1℃，pH5.5～6.5，厌气条件下培养三天。将筛选出的单菌落挑出移植到液体增殖培养基内，在53±1℃，pH5.5～6.5，培养二天。取出5ml，再加入到15ml pH=7.0～7.2的磷酸-磷酸钠缓冲溶液之中，摇匀后加入无水乙醇1.5ml，另外加入0.5ml硫酸二乙酯原液，混匀反应60分钟，取出立即加入25％的硫代硫酸钠溶液15ml，摇均匀静止15分钟。将处理后的溶液，稀释适当的倍数，直接在分离培养基2涂布平板分离。将筛选出的单菌落挑出移植到斜面培养基中，于53±1℃，pH5.5～6.5，培养3～4天。再进行摇瓶试验，筛选出L-乳酸纯度高于95％的菌株6株。
获得的嗜热性乳酸杆菌命名为Lt616，其特性如下该菌在天然培养基上的发酵条件厌氧发酵，温度53±1℃，pH5.5～6.5，发酵时间3～4天；外观形态粗状稍弯直长杆状，不规则，少见分段。杆状φ:1.0～0.9μ,L:3～7μ.液面特征不产膜，生成轮圈；生理特性革兰氏阳性菌，产L(+)-乳酸，同型乳酸发酵，无消旋酶。
实施例2发酵生产L-乳酸实施例1筛选获得的嗜热性乳酸杆菌53℃静止培养48-72小时后可供使用或冰箱保存。
ⅰ)一级种子250ml三角瓶取250ml三角瓶，加入200ml种子培养基，经过淀粉酶和糖化酶液化及糖化后，53℃静止培养20-40小时，并流加无菌碳酸钙。
ⅱ)二级种子5升自控玻璃罐在5升自控玻璃罐中加入种子培养基4升，经过淀粉酶和糖化酶的液化及糖化后，接入三角瓶内的培养基，接种量为10％。在转速100转/分、53℃下培养20-40小时，并流加无菌碳酸钙。
ⅲ)三级种子200升种子罐在200升种子罐中加入种子培养基100升，经过淀粉酶和糖化酶的液化及糖化后，接入5升自控玻璃罐中的二级种子，接种量为10％。在转速100转/分、53℃下培养20-40小时，并流加无菌碳酸钙。
ⅳ)1000升发酵罐发酵罐装液量为500升，接种量为20％。用自来水将原料调匀，加10～15U/克淀粉淀粉酶并升温，在90～95℃液化15分钟至液化完全。用水定容并冷却至60℃，加100～150U/克淀粉糖化酶糖化48小时灭菌，在52℃后接种。在52℃、转速100转/分下培养3-4天，并流加碳酸钙。在发酵过程中，随时流加无菌碳酸钙调节pH5.5～6.5。当发现随着时间的推移，发酵不再产酸或略微产酸即认为发酵结束。
用费林氏法测定发酵液总糖。用EDTA法测出乳酸钙含量，再换算成乳酸量。由于筛选菌种过程中就对发酵液进行纸层析检测，除乳酸斑点外几乎无其他副产物斑点。因此可视总酸为乳酸含量。
乳酸的光学纯度可用装备了手性分析柱的高压液相色谱仪(岛津液相色谱仪LC-6A)来测定。
下表1、2和3分别列出了250ml三角瓶、5升自控玻璃罐以及1000升发酵罐的结果。
表1 250ml三角瓶试验结果
表25升自控玻璃罐试验结果
表3 1000升发酵罐连续三批试验结果
从表1、2和3的结果表明，无论是小试摇瓶水平还是中试规模，L-乳酸纯度均高于95％，产酸率达到7.0-7.5％，转化率为90-95％。这说明该菌株Lt616的遗传性能比较稳定，不会随着规模的扩大而变化，能适应大规模的产业化生产。
本文公开和揭示的所有组合物与方法可通过借鉴本文公开内容无需进行过多试验而制得和实施。尽管本发明的组合物和方法已经通过较佳实例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的组合物、方法、以及方法步骤和步骤次序作改动。更具体地，明显可用化学和生理上相关的某些试剂代替本文所述的试剂来获得相同或相似的结果。所有这些相似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括附加权利要求定义的本发明精神、范围和内容中。
权利要求
1．一种新的发酵生产高纯度L-乳酸的方法，该方法包括用产L-乳酸的嗜热性乳酸杆菌高温厌氧发酵生产L-乳酸。
2．根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵温度为52℃-58℃。
3．根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵温度为52℃-54℃。
4．根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵液中L-乳酸的纯度高于95％。
5．根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵液中L-乳酸的纯度高于97％。
6．根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的产L-乳酸的嗜热性乳酸杆菌可通过在高温下厌气培养数天后，以L-乳酸纯度为标准筛选获得。
7．根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还可任选地进行紫外诱变筛选和化学诱变筛选。
8．根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述产L-乳酸的嗜热性乳酸杆菌是嗜热性乳酸杆菌Lt616。
全文摘要
本发明提供了一种新的发酵生产高纯度L－乳酸的方法,该方法包括用产L－乳酸的嗜热性乳酸杆菌高温厌氧发酵生产L－乳酸。该发酵工艺通过利用高温条件抑制了产D型乳酸的德氏乳酸杆菌的生长,从而使得发酵产物的L－乳酸纯度高于95%。
文档编号C12P7/40GK1306091SQ0011145
公开日2001年8月1日 申请日期2000年1月17日 优先权日2000年1月17日
发明者虞东胜 申请人:上海市工业微生物研究所