专利名称：一种用于测定β-微管蛋白III 基因表达的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体涉及到使用定量荧光PCR确定β-微管蛋白 III (β-tubulin III)在肿瘤细胞的基因表达和一种用于检测β-微管蛋白III表达的引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术：
肿瘤是机体的正常细胞在各种致癌因素下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的。当肿瘤细胞继续高速生长和分裂，生长处于失控状态，能侵入正常组织，并常常转移到远离其起源的部位生长，就会形成恶性肿瘤即癌症。当肿瘤形成时，临床的目标是希望可以选择性的杀死肿瘤细胞，同时减轻在治疗过程中，对机体正常细胞的损害。化疗是指应用化学药物治疗癌症的方法。化疗药物可以杀死癌细胞，抑制癌细胞的生长和繁殖，从而到达治疗或治愈的目的，化疗在杀伤癌细胞的同时，也会杀伤正常的细胞，产生毒副作用。肿瘤化疗作为一种全身性治疗，是目前临床恶性肿瘤治疗的主要手段之一。可消灭肿瘤原发灶及远距离转移的癌细胞，因此在肿瘤治疗中占有很重要的地位。目前研制出的化疗药物中，主要包括抗微管类药物，如紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱和长春瑞滨等，其主要作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药物。另一类为损害细胞的DNA，如顺钼和卡钼类药物，这些药物通常被称作基因毒性药物。 其它类的化疗药物是干扰核酸生物合成，蛋白质合成及功能，如5-氟尿嘧啶，吉西他滨，甲氨蝶呤类药物，这些通常被称作抗代谢药物。然而，化疗药物的疗效与患者个体差异有关， 这些差异包括病人对化疗药物的敏感程度以及对药物的耐受程度不同，同一个患者，某些化疗药物会有很好的疗效，而另一些药物则疗效差，甚至有些药物会产生严重的毒副作用。已有研究表明，肿瘤细胞内某些基因表达与化疗药物对肿瘤作用的敏感性和药物的耐受程度有一定关系。不同肿瘤细胞对同一种药物的敏感性不同，同一肿瘤细胞对不同药物的反应也存在差异。因而，在化疗给药过程中，对每种药物的敏感性或抗性决定因素的鉴定和检测成为设计个体化疗的有效工具。已经发现的抗细胞微管类并且广泛使用的化疗药物是紫杉醇类和长春碱类，紫杉醇类和长春碱类化疗药物主要作用于肿瘤细胞中构成细胞骨架的微管结构。细胞微管 (Microtubule)是真核生物细胞内重要的细胞骨架，是由13条原纤丝纵向排列构成中空的圆柱状结构体，每条原纤丝是tubulin α和β形成的二聚体所组成的。Tubulin α和β 担任着维持细胞形态功能，传递细胞信号信息，参与有丝分裂等重要功能。(Giarmakakou P, Sackett DL, Fojo T. Tubulin/Microtubules :still a promising target for new chemotherapeutic agents. J Natl Cancer Inst, 2000 ；92 ；3182-3.)人类细胞中存在着 6 种β微管蛋白同型体，其中3型β-微管蛋白与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系。紫杉醇类化疗药物作用于肿瘤细胞G2/M期，主要通过与β-tubulin III第31位氨基酸残基和第217-231位氨基酸残基结合，诱使微管蛋白聚合，抑制其解聚过程。使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致肿瘤细胞有丝分裂异常或停止，使肿瘤细胞无法继续分裂而死亡。Geve P, Dumontet C. Is class III beta-tubulin a predictive factor in patient receiving tubulin-binding agents ？ Lancet Oncol 2008 ；9 :168-75)与紫杉类化疗药物相类似的，长春碱类化疗药物是作用于β-tubulin III的175-213氨基酸残基，影响微管形成时新的微管蛋白二聚体的形成，使新形成的二聚体蛋白的原丝弯曲，不能延长，从而阻断微管聚合成纺锤体，破坏肿瘤细胞的有丝分裂，使微管和纺锤体失去正常功能而导致细胞死亡(Gan P，Pasquier E，Kavallris M. Class ΙΙΙ-tubulin mediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2007 ；67 :9356-63.)。已有研究报道，β -tubulin III的表达水平与紫杉醇类化疗药物和长春碱类化疗药物疗效存在密切联系。Seve等(SSve P,Mackey JjIsaac S, Tredan 0, Souquet PJ,PerolM, et al. Class III-Tubulin expression intumor cells predicts response and outcome inpatients with non-small cell lung cancer receiving paclitaxel. Mol Cancer Ther 2005 ；4 :2001-7.)以47例非小细胞肺癌患者为研究对象，发现在β-tubulin III高表达者中紫杉醇类化疗药物的治疗有效率为12.5%，而在β-tubulin III低表达者中其治疗有效率为61.9%，β-tubulin III低表达患者的无复发生存期和总生存期均明显长于高表达者。Rosell 等人(Rosell R, Scagliotti G, Danenberg KD, Lord RV, Bepler G, Novell 0， et al. Transcripts in pretreatment biopsies from a three-arm randomized trial in metastatic non-small-cell lungcancer. Oncogene 2003 ;22 :3548-52.)研究检测了非小细胞肺癌患者中β-tubulin III基因的mRNA表达水平，结果发现在接受长春碱/顺钼化疗方案的患者中，低表达β-tubulin III mRNA的患者有更高的化疗有效率，其生存期有明显的延长的趋势，预示了 β-tubulin III的表达水平可作为预测非小细胞肺癌患者对长春碱化疗疗效的重要指标。因此，β-tubulin III在肿瘤内表达的水平可以用来确定紫杉醇类化疗药物和长春碱类化疗药物是否可以有效治疗癌症的主要预后因素。临床成本效益(Costeffectiveness)分析研究表明(A Clegg, DA Scott, P Hewitson, M Sidhu, N ffaugh. Clinical and cost effectiveness of paclitaxel, docetaxel, gemcitabine, and vinorelbine in non—small cell lung cancer -.a systematic review. Thorax 2002 ;57 :20_8.)，采用紫杉醇类或长春碱类化疗药物治疗肺癌可以明显增加肿瘤患者的生存期，并且这种生存期的延长并没有显现出生存质量 (Quality of Life)的下降和治疗费用支出的增加。研究发现，对肺癌患者接受以紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合钼类化疗药物为治疗的方案是非常受益的。 β -tubulin III基因作为与紫杉醇类和长春碱类化疗药物敏感性密切相关基因，因此，在实施化疗之前对于β-tubulin III基因表达检测对于增加患者生存期，提高治疗生命质量，减少患者治疗成本，具有很重要的意义。目前，包括β-tubulin III表达在内的定量检测基因表达的测定方法是分子生物医药领域研究的热点之一，其定量检测基因表达方法的灵敏度，准确性及衡量基因表达高低的计算方法，备受分子生物医药研究人员所关注。迄今为止，在该技术领域仍然没有较大的进展。因此，特别需要一种可以高效快速，高准确率，高灵敏度的定量基因表达的检测方法和一种简便的，可以直观衡量基因表达高低的计算方法，以便提供肿瘤治疗的早期预后。本发明提供一种检测患者肿瘤细胞中的β-tubulin III mRNA表达量的检测方法， 从而评估各种石蜡包埋和新鲜组织中的β-tubulin III表达水平，以预测肿瘤患者对紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合钼类药物治疗的可能的抗性。本发明同时提供了一种高效，高准确率，高灵敏度的实时定量荧光PCR检测方法和检测试剂盒及一种衡量基因表达高低的新的计算方法。
发明内容
本发明一方面提供了评估测定石蜡包埋和新鲜组织细胞中β-tubulin III mRNA 表达水平的方法。本发明另一方面提供一种确定患者的化疗方案的方法，包括从肿瘤组织样品中分离RNA ；测定样品中β -tubulin III基因的表达水平；β -tubulin III基因的表达水平与 β-tubulin III基因的参照组进行比较；基于β-tubulin III基因的表达与参照组表达水平进行比较来确定的化疗方案。如果所述β-tubulin III表达小于或等于β-tubulin III 表达水平的25%分位值，那么选择包含紫杉醇类或长春碱类以及紫杉醇类或长春碱类联合钼类的化疗药物进行治疗，而如果β-tubulin III表达水平高于75%分位值，那么选择不含紫杉醇类或长春碱类以及紫杉醇类或长春碱类联合钼类的化疗为宜。本发明在实施方案中，提供用于测定β-tubulin基因表达的引物和探针的序列见表1。表1引物和探针序列
权利要求
1.用于检测β-tubulinIII基因表达的引物和探针，包括 TUBB3-F TCTACTACAACGAGGCCTCTTCTTUBB3-R CAAAGATGAAATTGTCAGGCCTGAA TUBB3-P AGCCACACCAGAATGGCTCGAGGCACGTACCTCG TUBB3-反转录-TTGCCGGCCCCACTCTGACCAAA。
2.一种用于测定β-tubulin III mRNA量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
3.一种用于扩增微管蛋白III mRNA的引物，其特征在于与权利要求2所述的引物序列基本上相同，所述的序列基本上相同是指在严格条件下与靶杂交的核苷酸对比时， 有70%以上的核苷酸相同的核苷酸片段。
4.如权利要求2所述的一种用于测定β-微管蛋白IIImRNA表达的PCR反应试剂盒还包含逆转录酶，DNA聚合酶，缓冲液，其中荧光PCR反应扩增体系如下cDNA 模板0.01 1.0 ng/uL弓I物1 5 pmol缓冲液终浓度为0.1 10 XiTaq 酶0. 01 1. 0 Unit/yLMg2+终浓度为1 9 mM探针0. 5 4 pmoldNTP终浓度为0. 1 1. 0 mM。
5.用于确定β-tubulin III基因表达量的方法，所述方法包括(a)从石蜡包埋组织或新鲜组织中分离mRNA;(b)由分离的mRNA合成cDNA；(c)测定样品中β-tubulinIII mRNA的量；(d)计算包括β-tubulinIII在内的基因表达量的计算公式，所述的用于计算包括 β-tubulin III在内的基因表达量的计算公式，包括记录β-tubulin III基因标准曲线上的数值Cl，检测样品在内参基因β-actin标准曲线上的数值C2，再求相对比值=C1/C2，然后对相对比值取自然对数，即基因表达量= ln(Cl/C2)。
全文摘要
本发明提供了一种用于β-微管蛋白III表达测定的引物、探针及检测试剂盒，用于检测β-tubulin III基因表达的引物和探针，包括TUBB3-F TCTACTACAACGAGGCCTCTTCT；TUBB3-R CAAAGATGAAATTGTCAGGCCTGAA；TUBB3-P AGCCACACCAGAATGGCTCGAGGCACGTACCTCG；TUBB3-反转录-TTGCCGGCCCCACTCTGACCAAA。本发明的检测试剂盒可测定β-微管蛋白III mRNA的表达水平，为受试者提供基于紫杉醇类或长春碱类的治疗的可能抗性的方法。
文档编号C12N15/11GK102409087SQ20111023060
公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者张海龙, 施伟杰, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司