一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法

一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法。本发明提供的制备方法，包括如下步骤：将所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊分散在含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中，反应，收集沉淀，得到葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系；将微管、所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系、ADP、磷酸二氢钠、过氧化氢酶和β-巯基乙醇混匀，得到分散液；将酪蛋白水溶液、kinesin水溶液和所述分散液依次注入流体池，所述流体池中的所有物质组成微管-驱动蛋白运输体系。本发明中的葡萄糖氧化酶微球或胶囊不仅可以为微管-驱动蛋白运输体系提供葡萄糖响应性的能量供给，还能作为载体运输不同的物质。
【专利说明】一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系 及其制备方法。

【背景技术】
[0002] 所有生物的运动系统都与能量的输运有着密切的联系，这主要是具有马达功能的 大分子蛋白做功的结果，这些蛋白质被称为分子马达或马达蛋白。到目前为止，人类已确定 了上百种马达蛋白，它们在机体内发挥着各种各样的功能，按其运动形式可分为线性运动 马达和旋转运动马达。其中旋转马达ATP合成酶（F/i-ATPase)的旋转运动能够催化合成 ATP，为细胞活动提供能量，是能量转化的核心酶，因此启发了广大科研工作者开展旋转马 达ATP合成酶的仿生研究。作为一种跨膜蛋白，ATP合成酶已经被成功重构在脂质体内，在 该体系内ATP合成酶的功能近似于生物体内。为了提高体系的稳定性、智能性和尺寸的可 调控性，近年来一些研究者成功将ATP合成酶重构在磷脂覆盖的聚合物或蛋白质微胶囊表 面，更好地模拟了其在生物细胞内的功能，同时也扩展了 ATP合成酶在生物和纳米器件等 方面的应用前景。
[0003] 驱动蛋白（kinesin)是细胞内的一种线性马达蛋白分子，它可以水解三磷酸腺苷 (ATP)，将化学能转换成机械能，从而沿着细胞骨架微管（microtubule, MT)定向运输纳米 货物（如囊泡、染色体、细胞器等）。鉴于这种马达分子运动的强健性和高效性，在构筑微米 或纳米级尺度上的活性仿生体系时，kinesin成为一种理想的驱动部件，吸引了越来越多科 学家的兴趣。在过去的十多年里，微管被广泛用作为载体在kinesin修饰的表面上运输货 物（如聚苯乙烯球、量子点、DNA分子）。然而，要将这些运输体系应用到实际应用中，需要 发展一些智能响应性的体系来更好地控制其运输。例如，一些研究者使用ATP笼状化合物， 通过紫外光的开关来控制kinesin驱动的microtubule运动；还有一些课题组通过使用电 响应性的聚合物或温度响应性的聚合物来控制kinesin驱动的microtubule运动。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系的制备方法。
[0005] 本发明提供的制备方法，包括如下步骤：
[0006] 1)分别制备葡萄糖氧化酶微球或微胶囊、含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液；
[0007] 上述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊可利用模板法、共沉淀法、层层自组装、乳液法或 盐析法制备，
[0008] 葡萄糖氧化酶微球具体按照如下方法制备：取Na2C03水溶液、G0D水溶液、CaCl 2水 溶液混匀，静置反应，离心取沉淀物，即得到G0D微球；上述反应中，Na2C03、G0D和CaCl 2质 量配比为1 :1-10 :1，具体为35 :4 :37 ;
[0009] 葡萄糖氧化酶微胶囊具体按照如下方法制备：首先，将粒径为2 μ m的碳酸锰粒子 分散到含有0. 1M氯化钠的聚烯丙基胺盐酸盐（PAH)溶液中，振荡吸附30min后，离心分离 收集沉淀，充分洗涤后，再分散到含有〇.〇25wt%的戊二醛（GA)水溶液中吸附lh，离心分离 收集沉淀，水洗3次，得到微球；然后将得到的微球再分散到含有0. 1M氯化钠的4mg/mL GOD 水溶液中吸附3h，离心分离收集沉淀，水洗3次；依次重复吸附GA、G0D的操作，直到所需的 层数；然后向得到的微球中加入〇. 1M的乙二胺四乙酸二钠盐溶液，震荡反应3h，溶除碳酸 锰粒子，离心收集沉淀、洗涤3次后，得到（GA/G0D)n微胶囊。每吸附一次GA、GOD为一层。 在本发明的实施例中为6层，得到（GA/G0D) 6微胶囊，粒径为2 μ m。
[0010] 所述碳酸猛粒子、PAH、戊二醒、GOD的质量比为160mg :4mg :lmg :8mg。
[0011] 葡萄糖氧化酶微胶囊还可以多组装了一层过氧化氢酶（CAT)得到了（GA/G0D)6GA/ CAT/GA/G0D微胶囊，具体为将（GA/G0D)6微胶囊分散到含有0.025wt%的戊二醛（GA)水 溶液中吸附lh，离心分离收集沉淀，水洗3次；再将得到的微球分散到含有0. 1M氯化钠的 4mg/mL CAT水溶液中吸附3h，离心分离收集沉淀，水洗3次；同样操作，再在微球表面依次 吸附GA、G0D ;然后向得到的微球中加入0. 1M的乙二胺四乙酸二钠盐溶液，震荡反应3h，溶 除碳酸锰粒子，离心收集沉淀、洗涤3次后，得到（GA/G0D)6GA/CAT/GA/G0D微胶囊；其中，碳 酸猛粒子、？八!1、戊二醒、600、041'的配比为质量比为16〇11^ :411^:111^:811^:811^。
[0012] 上述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液按照包括如下步骤的方法制备：将ATP合成 酶、去垢剂Triton-100、脂质体在缓冲液（含有终浓度为40mM NaCl和5mM MgCl2的pH8. 0 的20mM Tricine缓冲液）中混勻，4°C搅拌反应lh ;再加入Bio-beads室温搅拌反应lh去 除去垢剂，离心收集上清液，重复3次；即得到含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液，上述反应 中ATP合成酶、Triton-100、脂质体的质量配比为0· 05mg :16mg :10mg(0. 01?0· 05mg :8? 16mg :1 ?10mg)。
[0013] 所述脂质体为将如下两种物质按照如下质量比混匀后水化得到脂质体：二豆蘧酰 磷脂酰胆碱（DMPC) :二豆蘧酰磷酸钠（DMPA)质量配比为9:1，具体按照如下方法制备：称 取二豆蘧酰磷脂酰胆碱（DMPC)和二豆蘧酰磷酸钠（DMPA)(质量比9:1)同时溶于氯仿与 甲醇（体积比1:1)的混合溶剂中，超声使其完全溶解，30°C旋转蒸发得到均匀干脂膜，加 60°C水水化，形成脂质悬浮液，对脂质悬浮液水浴超声直至得到澄清透明的PA/PC脂质体 (10mg/mL) 〇
[0014] 2)将所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊分散在含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中， 反应，收集沉淀，得到葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系；
[0015] 3)将微管、所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系、ADP、磷酸二氢 钠、过氧化氢酶和β-巯基乙醇混匀，得到分散液；
[0016] 4)将酪蛋白水溶液、kinesin水溶液和所述分散液依次加入反应容器中混匀，得 到微管-驱动蛋白运输体系。
[0017] 上述方法中，
[0018] 步骤1)中，所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊的粒径为1-4 μ m，所述葡萄糖氧化酶 微球粒径具体为2. 6 μ m或4 μ m，所述微胶囊的粒径为具体2 μ m或3 μ m微胶囊；
[0019] 所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中ATP合成酶的终浓度为100-500nM，所述含 ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中ATP合成酶的终浓度具体为200nM ;
[0020] 步骤3)中，所述微管为罗丹明标记的生物素修饰的微管；
[0021] 所述罗丹明标记的生物素修饰的微管按照包括如下步骤的方法制备：：罗丹明标 记的微管、生物素修饰的微管和未修饰的微管（体积比1 :1 :2,微管的浓度均为5mg/mL)混 合好后分散于含有4mM MgCl2、lmM GTP (三磷酸鸟苷）和质量百分含量5% DMSO的BRB80 缓冲液中，总蛋白浓度为2. 5mg/ml ;然后放入37°C的水浴中孵育30min后，加入4μ L的含 20 μ M taxol (紫杉醇）的BRB80缓冲液中，即可得到罗丹明标记的生物素修饰的微管。
[0022] 所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系为链霉亲和素修饰的葡萄 糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系。
[0023] 在本发明的实施例中，采用链霉亲和素修饰的葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶 组装体系，具体按照如下方法制备：将500 μ L (G0D含量为0. 2mg/mL) G0D微胶囊/ATP合成 酶组装体系分散到10 μ L 50 μ Μ链霉亲和素的水溶液中，吸附30min,离心收集沉淀，水洗 三次，得到链霉亲和素修饰的G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系分散液，即为链霉亲和素修 饰的葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组装体系。
[0024] 上述方法中，
[0025] 步骤2)中，所述葡萄糖氧化酶微球与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中的蛋 白脂质体质量配比为10-16 :5,所述葡萄糖氧化酶微球与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体 溶液中的蛋白脂质体质量配比具体为16 :5 ;
[0026] 或所述葡萄糖氧化酶微胶囊中葡萄糖氧化酶含量与所述含ATP合成酶的蛋白脂 质体溶液中的蛋白脂质体质量配比为1 :1〇-25,所述葡萄糖氧化酶微胶囊中葡萄糖氧化酶 含量与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中的蛋白脂质体质量配比具体为1 :25 ;
[0027] 步骤4)中，
[0028] 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微球/ATP合成酶组装 体系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比为0. 025mg : 1-1. 5pmol : 1-5 μ g :50_100 μ g :0· 1-0. 5 μ mol :0· 1-0. 5 μ mol :0· 01-0. 05 μ g : 1-5 μ g ;
[0029] 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微球/ATP合成酶组装体 系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比具体为0. 025mg : 1. 5pmol ：5 μ g ：80 μ g ：0. 5 μ mol ：0. 25 μ mol ：0. 04 μ g ：2. 5 μ g ；
[0030] 或所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组 装体系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比为0. 03mg : 1-1. 5pmol ：1~5 μ g ：1~5 μ g ：0. l-〇. 5 μ mol ：0. l-〇. 5 μ mol ：0. 01-0. 05 μ g ：1~5 μ g ；
[0031] 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组 装体系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β-巯基乙醇的配比具体为 0. 03mg ：1. 35pmol ：5 μ g ： 1 μ g ：0. 5 μ mol ：0. 25 μ mol ：0. 04 μ g ：2. 5 μ g ；
[0032] 所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组装体系为链霉亲和素修饰的葡萄糖氧化 酶微胶囊/ATP合成酶组装体系。
[0033] 上述方法中，
[0034] 步骤2)中，所述反应时间为30min ;
[0035] 步骤4)中，所述kinesin水溶液加入时间为待酪蛋白水溶液加入后5min ;
[0036] 所述分散液加入时间为述kinesin水溶液加入后5min。
[0037] 上述方法中，
[0038] 步骤1)中，所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊为装载聚电解质、蛋白质、多糖或药 物的微球或微胶囊。
[0039] 步骤4)中，所述kinesin为kinesin-Ι，其氨基酸序列为序列表中序列1。
[0040] 上述方法制备的葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系也是本发明保护的范围。
[0041] 上述葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系在制备纳米器件中的应用也是本发 明保护的范围。
[0042] 上述葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系在作为运输载体中的应用也是本发 明保护的范围。
[0043] 本发明的实验证明，本发明制备一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系，该 运输体系具有如下优点：
[0044] (1)本发明的微管-驱动蛋白运输体系具有葡萄糖响应性，在有葡萄糖的溶液中， ATP合成酶可将体系中的ADP转化成ATP，kinesin能驱动微管运输；在无葡萄糖的溶液中， 无 ATP产生，kinesin不能驱动微管运输。
[0045] (2)本发明的微管-驱动蛋白运输体系能够自供给能量，无需额外加入ATP。
[0046] (3)本发明的微管-驱动蛋白运输体系能够实现ATP的再生，缓冲体系中ATP的浓 度，从而保证ATP的持续供给。
[0047] (4)本发明中的葡萄糖氧化酶微球或胶囊不仅可以为微管-驱动蛋白运输体系持 续提供能量，还能作为载体运输不同的物质。
[0048] (5)本发明中的微管-驱动蛋白运输体系能够实现局部控制（即只在有葡萄糖的 区域，微管可以运动；没有葡萄糖的区域，微管不能运动）微管-驱动蛋白运输体系。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1为本发明实施例1制备的ATP合成酶蛋白脂质体的透射电子显微图（图1A) 和ATP合成酶蛋白脂质体在葡萄糖氧化酶微球表面吸附的透射电子显微图（图1B)。
[0050] 图2为实施例1中重组了 F^-ATPase蛋白脂质体的葡萄糖氧化酶微球产生的ATP 随时间变化曲线图。
[0051] 图3为实施例1中微管在驱动蛋白修饰的表面上运动的速度-时间关系曲线。

【具体实施方式】
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 下述实施例中，所用的流体池是按照如下方法制备的：
[0055] 普通流体池由载玻片、盖玻片和双面胶组成（Scotch 3M，0. 1mm厚）。载玻片和盖 玻片先在饱和Κ0Η溶液中超声lOmin,然后用乙醇和去离子水清洗，再用液氮吹干。如无特 殊说明，实验用的都是普通流体池。
[0056] 下述实施例中，所用的罗丹明标记的生物素修饰的微管的制备方法为：罗丹明标 记的微管、生物素修饰的微管和未修饰的微管（体积比1 :1 :2,微管的浓度均为5mg/mL)混 合好后分散于含有4mM MgCl2、lmM GTP (三磷酸鸟苷）和质量百分含量5% DMS0的BRB80 缓冲液中，总蛋白浓度为2. 5mg/ml ;然后放入37°C的水浴中孵育30min后，加入4μ L的含 20 μ M taxol (紫杉醇）的BRB80缓冲液中，即可得到罗丹明标记的生物素修饰的微管。
[0057] 其中，罗丹明标记的微管、生物素修饰的微管和未修饰的微管均购自 Cytoskeleton有限公司，商品目录号分别为TL590M、T333P和TL238。
[0058] 下述实施例中，所用的驱动蛋白为Kinesin-Ι (其氨基酸序列为序列表中序列 1 :)是按照如下方法制备的：全长黑腹果蝇C端组氨酸标记的kinesin重链以及轻链的 kinesin质粒在大肠杆菌Escherichia coli (购自于中美泰和生物技术有限公司）中表 达，然后用镍一氨基三乙酸琼脂糖树脂（nickel-nitrilotriacetic acid agarose resin, Ni-NTA)柱和磷酸纤维素柱提纯表达的蛋白。
[0059] 实施例1、制备葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系
[0060] 1、葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系制备
[0061] (1)制备葡萄糖氧化酶（G0D)微球
[0062] 取浓度为0. 33M似20)3水液和浓度为4mg/ml G0D水溶液于圆底烧瓶中，随后一次 性快速加入等体积的浓度为〇. 33M CaCl2水溶液于烧瓶中，立即搅拌混匀20s，静置反应约 2min，离心取沉淀物，3次水洗，得到4 μ m的G0D微球。
[0063] 上述反应中，Na2C03、G0D和CaCl2质量配比为1 :1-10 :1，具体为35 :4 :37 ;
[0064] (2)制备含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液
[0065] ATP合成酶按照如下方法制备：将新鲜的菠菜叶子，去除中脉、清洗；在搅拌机中 搅拌叶子至完全呈米粒状大小，用尼龙袋过滤，去除滤渣；取滤液离心，收集沉淀物，放入低 渗缓冲溶液（10mM Tris-HCl pH 8.0和0. 5mM MgCl2)中，搅拌，离心，取沉淀物放入高离子 强度洗液缓冲液（〇. 4M 蔗糖、10mM Tris-HCl pH 8. 0、150mM NaCl 和 0. 5mM MgCl2)中，搅 拌，离心，取沉淀物加入悬浮缓冲液（0. 4M鹿糖、50mM Tricine-NaOH pH 8. 0、0. 2mM MgCl2) 中。向其中加入固体DTT(终浓度50mM)，搅拌；随后加入等体积的提取缓冲液，4°C下搅拌 30min，离心，取上清液加入（NH4) 2S04粉末，离心，收集沉淀物；将得到的粗蛋白溶液与等 体积的密度梯度缓冲溶液混合，在依次为：60 %、52 %、44%、36 %、28 %、20 %的蔗糖密度梯 度中离心，收集44%蔗糖层，即为ATP合成酶，最终的缓冲溶液为：1. 25mM sucrose，30mM Na2HP04-Na0H pH 7. 2, 2mM MgCl2, 0. 5mM Na2EDTA, 4mM dodecyl maltoside，液氮中存吧。
[0066] 脂质体为将如下两种物质按照如下质量比混匀后水化得到脂质体：二豆蘧酰磷脂 酰胆碱（DMPC) :二豆蘧酰磷酸钠（DMPA)质量配比为9:1，具体按照如下方法制备：称取二 豆蘧酰磷脂酰胆碱（DMPC)和二豆蘧酰磷酸钠（DMPA)(质量比9:1)同时溶于氯仿与甲醇 (体积比1:1)的混合溶剂中，超声使其完全溶解，30°C旋转蒸发得到均匀干脂膜，加60°C水 水化，形成脂质悬浮液，对脂质悬浮液水浴超声直至得到澄清透明的PA/PC脂质体（10mg/ mL)。
[0067] 将ATP合成酶、去垢剂Triton-100、脂质体在缓冲液（含有终浓度为40mM NaCl和 5mM MgCl2的ρΗ8· 0的20mM Tricine缓冲液）中混匀，4°C搅拌反应lh ;再加入Bio-beads 室温搅拌反应lh去除去垢剂，离心收集上清液，重复3次；即得到含ATP合成酶的蛋白脂质 体溶液，浓度为5mg/ml，液氮中保存，ATP合成酶在含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中的终 浓度为200nM。
[0068] 上述反应中ATP合成酶、Triton-100、脂质体的质量配比为0. 05mg :16mg : 10mg(0. 01 ?0· 05mg :8 ?16mg :1 ?10mg)。
[0069] 上述制备的蛋白脂质体的透射电子显微图如图1A所示，蛋白脂质体的平均粒径 为 180nm。
[0070] (3)制备GOD微球/ATP合成酶组装体系
[0071] 把步骤（1)制备的500 μ L 16mg/mL的G0D微球分散到500 μ L 5mg/mL含ATP合成 酶的蛋白脂质体溶液中，震荡均匀，吸附30min，4°C离心洗涤，收集沉淀即为G0D微球/ATP 合成酶组装体系（透射电子显微图如图1B所示）。
[0072] 检测G0D微球/ATP合成酶组装体系ATP的含量如下：
[0073] 将得到的G0D微球/ATP合成酶组装体系分散到2mL含有18wt%葡萄糖的缓冲溶 液（pH 8.0,含 10mM tricine，30mM NaCl，2.5mM MgCl2,5mM NaH2P04 和 0.2mM ADP)中，从 体系中取出20 μ L的样品，加入到荧光素-荧光素酶ATP测量体系中，用发光仪测量发光信 号，从而计算出体系中ATP的含量。
[0074] 结果如图2所示，加入葡萄糖，随着反应时间的增加，ATP浓度持续上升，实现了葡 萄糖响应的ATP的可控合成。
[0075] (4)葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系的获得
[0076] 制备分散液：2 μ L 2. 5mg/mL罗丹明标记的生物素修饰的微管、5 μ L 16mg/mLG0D 微球/ATP合成酶组装体系、25yL 20mM ADP、25yL 10mM磷酸二氢钠（NaH2P04)、5yL 0. 008mg/mL过氧化氢酶和0. 5 μ L 0. 5wt% β -巯基乙醇水溶液混匀，得到分散液。
[0077] 微管-驱动蛋白运输体系制备：
[0078] 首先，将酪蛋白（lmg/mL)溶液注入流体池中，吸附5min ;然后将kinesin-Ι水溶 液（20nM)注入流体池中，吸附5min ;然后，将上述分散液缓慢注入流体池中，得到微管-驱 动蛋白运输体系。
[0079] 微管-驱动蛋白运输体系中各物质如下：50 μ L 0. 5mg/mL酪蛋白、50 μ L 30nM kinesin_l、2yL 2. 5mg/mL罗丹明标记的生物素修饰的微管、5yL 16mg/mL GOD微球/ATP 合成酶组装体系、25 μ L 20mM ADP、25 μ L 10mM 磷酸二氢钠（NaH2P04)、5 μ L 0. 008mg/mL 过 氧化氢酶、〇· 5 μ L 0· 5wt% β -巯基乙醇水溶液；
[0080] 微管-驱动蛋白运输体系中各物质的配比如下：酪蛋白、kinesin-Ι、罗丹明标记 的生物素修饰的微管、G0D微球/ATP合成酶组装体系、ADP、磷酸二氢钠（NaH 2P04)、过氧 化氢酶、β _ 巯基乙醇的配比为 〇· 〇25mg :1. 5pmol :5 μ g :80 μ g :0· 5 μ mol :0· 25 μ mol : 0· 04μ g :2· 5μ g。
[0081] 2、检测微管-驱动蛋白运输体系对葡萄糖响应能力
[0082] 将上述微管-驱动蛋白运输体系中加入终浓度为26wt% (质量百分含量）的葡萄 糖，混匀，将流体池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察。以未加葡萄糖为对照。
[0083] 记录下MT随时间的运动图像，结果如图3所示，未加葡萄糖的体系中，微管不运 动；而加葡萄糖的体系，随着时间的推移，微管MT可以成功地在kinesin-Ι修饰的表面上滑 动，滑动速度平均为19nm/s。
[0084] 实施例2、制备葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系
[0085] 1、葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系制备
[0086] 本实施例葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系制备的步骤和参数与实施例1中 1基本相同，不同在于步骤（1):
[0087] (1)制备加载药物的葡萄糖氧化酶（G0D)微球
[0088] 取浓度为0. 33M含有2mg/mL异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran)的Na2C03 水液和浓度为4mg/mL GOD水溶液于圆底烧瓶中，随后一次性快速加入等体积的浓度为 0. 33M CaCl2水溶液于烧瓶中，立即搅拌20s，静置反应约2min，离心取沉淀物，3次水洗，得 到G0D-药物复合微球（粒径为2. 6 μ m)。
[0089] 上述反应中，Na2C03、FITC-Dextran、GOD 和 CaCl2 的质量配比为 35mg :2mg :4mg : 37mg ；
[0090] ⑵制备含ATP合成酶的蛋白脂质体
[0091] 与实施例1的1的⑵相同；
[0092] (3)制备G0D微球/ATP合成酶组装体系
[0093] 与实施例1的1的（3)相同，得到G0D微球/ATP合成酶组装体系；
[0094] (4)葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系的获得
[0095] 与实施例1的1的（4)相同，得到微管-驱动蛋白运输体系；
[0096] 2、检测微管-驱动蛋白运输体系对葡萄糖响应能力
[0097] 与实施例1的2相同，不加葡萄糖的体系中，微管不运动；而加葡萄糖的体系，随着 时间的推移，微管MT可以成功地在kinesin修饰的表面上滑动，滑动速度平均为30nm/s。
[0098] 3、微管-驱动蛋白运输体系在运输载体中的应用
[0099] 将上述2制备的微管-驱动蛋白运输体系移至共聚焦显微镜下观察，共聚焦实验 表明，微管-驱动蛋白运输体系可以运输异硫氰酸荧光素-葡聚糖。
[0100] 因此，可以认为微管-驱动蛋白运输体系可以定向运输药物，在葡萄糖刺激下的 载有药物的微管-驱动蛋白运输体系在移动到不含葡萄糖体系中停止移动，从而卸载药 物，实现定向运输药物。
[0101] 实施例3、制备葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系
[0102] 1、葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系制备
[0103] (1)制备G0D微胶囊（微胶囊这个实施例是制备微胶囊，也可以制备纳米胶囊，只 是模板不是碳酸锰，换成纳米二氧化硅或者纳米碳酸钙）
[0104] 首先，将粒径为2 μ m的碳酸锰粒子分散到含有0. 1M氯化钠的PAH溶液（sigma 公司购买到）中，振荡吸附30min后，离心分离收集沉淀，充分洗涤后，再分散到含有 0. 025Wt%的戊二醛（GA)水溶液中吸附lh，离心分离收集沉淀，水洗3次，得到微球；
[0105] 然后将得到的微球再分散到含有0. 1M氯化钠的4mg/mL G0D水溶液中吸附3h，离 心分离收集沉淀，水洗3次；依次重复吸附GA、G0D的操作，直到所需的层数；然后向得到的 微球中加入〇. 1M的乙二胺四乙酸二钠盐溶液，震荡反应3h，溶除碳酸锰粒子，离心收集沉 淀、洗涤3次后，得到（64/600)"微胶囊。
[0106] 每吸附一次GA、G0D为一层，本实施例为6层，得到（GA/G0D) 6微胶囊，粒径为2 μ m。
[0107] 所述碳酸猛粒子、PAH、戊二醒、GOD的质量比为160mg :4mg :lmg :8mg。
[0108] (2)制备含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液
[0109] 与实施例1的1的（2)相同；
[0110] (3)制备G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系
[0111] 把步骤（1)制备的500 μ L (G0D含量为0. 2mg/mL) G0D微胶囊分散到500 μ L5mg/mL 含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中，震荡均匀，吸附30min，4°C离心洗涤，收集沉淀即为GOD 微胶囊/ATP合成酶组装体系。
[0112] (4)葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系的获得
[0113] 将（3) 500 μ L (G0D含量为0. 2mg/mL) G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系分散到 10 μ L 50 μ Μ链霉亲和素的水溶液中，吸附30min，离心收集沉淀，水洗三次，得到链霉亲和 素修饰的G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系分散液；再将5μ L(G0D含量为0. 2mg/mL)链霉亲 和素修饰的GOD微胶囊/ATP合成酶组装体系分散液逐滴加入到2 μ L 2. 5mg/mL罗丹明标 记的生物素修饰的微管溶液中，室温（25°C )下轻摇30min，再加入25μ L 20mM ADP、25y L 10mM磷酸二氢钠（NaH2P04)、5 μ L 0. 008mg/mL过氧化氢酶和0. 5 μ L 0. 5wt% β -巯基乙醇 混匀，得到分散液。
[0114] 微管-驱动蛋白运输体系制备：
[0115] 首先，将酪蛋白（lmg/mL)溶液注入流体池中，吸附5min ;然后将kinesin水溶液 (20nM)注入流体池中，吸附5min ;然后，将上述分散液缓慢注入流体池中，得到微管-驱动 蛋白运输体系。
[0116] 微管-驱动蛋白运输体系中各物质如下：60 μ L 0. 5mg/mL酪蛋白、45 μ L 30nM kinesin-l、2 μ L 2. 5mg/mL罗丹明标记的生物素修饰的微管、5 μ L(G0D含量为0· 2mg/mL) 链霉素修饰的GOD微胶囊/ATP合成酶组装体系、25yL 20mM ADP、25yL 10mM磷酸二氢钠 (NaH2P04)、5 μ L 0· 008mg/mL过氧化氢酶、0· 5 μ L 0· 5wt% β -巯基乙酉享水溶液；
[0117] 微管-驱动蛋白运输体系中各物质的配比为酪蛋白、kinesin-Ι、罗丹明标记 的生物素修饰的微管、链霉素修饰的G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系、ADP、磷酸二氢 钠（NaH 2P04)、过氧化氢酶、β -巯基乙醇的配比如下：0· 03mg :1. 35pmol :5 μ g :1 μ g : 0. 5 μ mol :0. 25 μ mol :0. 04 μ g :2. 5 μ g。
[0118] 2、检测微管-驱动蛋白运输体系对葡萄糖响应能力
[0119] 将上述微管-驱动蛋白运输体系中加入终浓度为18wt%的葡萄糖，混匀，将流体 池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察。以不加入葡糖糖为对照。
[0120] 将流体池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察，与实施例1的2相同，不加 葡萄糖的体系中，微管不运动；而加葡萄糖的体系，随着时间的推移，微管MT可以成功地在 kinesin修饰的表面上滑动，滑动速度平均为50nm/s。
[0121] 实施例4、制备葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系
[0122] 本实施例葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系制备的步骤和参数与实施例3中 1基本相同，不同在于步骤（1):
[0123] (1) (GA/G0D) nGA/CAT/GA/G0D 微胶囊
[0124] 本实施例的步骤和参数与实施例3中基本相同，区别在于：在制备G0D微胶囊时， 多组装了一层过氧化氢酶（CAT)，得到了（GA/G0D) nGA/CAT/GA/G0D微胶囊，具体如下：
[0125] 将实施例3的1的（1)步骤中得到的（GA/G0D) 6微球分散到含有0. 025wt %的戊二 醛（GA)水溶液中吸附lh，离心分离收集沉淀，水洗3次；再将得到的微球分散到含有0. 1M 氯化钠的4mg/mL CAT水溶液中吸附3h，离心分离收集沉淀，水洗3次；同样操作，再在微球 表面依次吸附GA、G0D ;然后向得到的微球中加入0. 1M的乙二胺四乙酸二钠盐溶液，震荡反 应3h，溶除碳酸锰粒子，离心收集沉淀、洗涤3次后，得到（GA/G0D) 6GA/CAT/GA/G0D微胶囊 (粒径为3 μ m)。
[0126] 所述碳酸猛粒子、PAH、戊二醒、GOD、CAT的配比为质量比为160mg :4mg :lmg :8mg : 8mg〇
[0127] (GA/GOD)nGA/CAT/GA/G0D微胶囊可以有效清除催化氧化葡萄糖产生的过氧化氢， 可以尽量减小体系中的过氧化氢浓度以及进一步生成的活性氧，减小活性氧对微管或驱动 蛋白的损伤。
[0128] (2)制备含ATP合成酶的蛋白脂质体
[0129] 与实施例3的1的（2)相同；
[0130] (3)制备G0D微胶囊/ATP合成酶组装体系
[0131] 与实施例3的1的（3)相同；
[0132] (4)制备微管-驱动蛋白运输体系
[0133] 与实施例3的1的（4)相同；得到微管-驱动蛋白运输体系。
[0134] 2、检测微管-驱动蛋白运输体系对葡萄糖响应能力
[0135] 将上述微管-驱动蛋白运输体系中加入终浓度为20wt%的葡萄糖，混匀，将流体 池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察。以不加入葡糖糖为对照。结果表明，不加 葡萄糖的体系中，微管不运动；而加葡萄糖的体系，随着时间的推移，微管MT可以成功地在 kinesin修饰的表面上滑动，滑动速度平均为26nm/s。
【权利要求】
1. 一种葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系的制备方法，包括如下步骤： 1) 分别制备葡萄糖氧化酶微球或微胶囊、含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液； 2) 将所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊分散在含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中，反 应，收集沉淀，得到葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系； 3) 将微管、所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系、ADP、磷酸二氢钠、 过氧化氢酶和β-巯基乙醇混匀，得到分散液； 4) 将酪蛋白水溶液、kinesin水溶液和所述分散液依次加入反应容器中混匀，得到微 管-驱动蛋白运输体系。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊的粒径为l-4ym; 所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中ATP合成酶的终浓度为100-500nM，所述含ATP 合成酶的蛋白脂质体溶液中ATP合成酶的终浓度具体为200nM ; 步骤3)中，所述微管为罗丹明标记的生物素修饰的微管； 所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系为链霉亲和素修饰的葡萄糖氧 化酶微球或微胶囊/ATP合成酶组装体系。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 步骤2)中，所述葡萄糖氧化酶微球与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中的蛋白脂 质体质量配比为10-16 :5,所述葡萄糖氧化酶微球与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液 中的蛋白脂质体质量配比具体为16 :5 ; 或所述葡萄糖氧化酶微胶囊中葡萄糖氧化酶含量与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体 溶液中的蛋白脂质体质量配比为1 :1〇_25,所述葡萄糖氧化酶微胶囊中葡萄糖氧化酶含量 与所述含ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中的蛋白脂质体质量配比具体为1 :25 ; 步骤4)中， 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微球/ATP合成酶组装体 系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β-巯基乙醇的配比为0.025mg : 1-1. 5pmol : 1-5 μ g :50_100 μ g :0· 1-0. 5 μ mol :0· 1-0. 5 μ mol :0· 01-0. 05 μ g : 1-5 μ g ; 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微球/ΑΤΡ合成酶组装体系、 所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比具体为0. 025mg : 1. 5pmol ：5 μ g ：80 μ g ：0. 5 μ mol ：0. 25 μ mol ：0. 04 μ g ：2. 5 μ g ； 或所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ΑΤΡ合成酶组装 体系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比为0. 03mg : 1-1. 5pmol ：1~5 μ g ：1~5 μ g ：0. l-〇. 5 μ mol ：0. l-〇. 5 μ mol ：0. 01-0. 05 μ g ：1~5 μ g ； 所述酪蛋白、所述kinesin、所述微管、所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组装体 系、所述ADP、所述磷酸二氢钠、所述过氧化氢酶、所述β -巯基乙醇的配比具体为0. 03mg : 1. 35pmol ：5 μ g ： 1 μ g ：0. 5 μ mol ：0. 25 μ mol ：0. 04 μ g ：2. 5 μ g ； 所述葡萄糖氧化酶微胶囊/ATP合成酶组装体系为链霉亲和素修饰的葡萄糖氧化酶微 胶囊/ATP合成酶组装体系。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 步骤2)中，所述反应时间为30min ; 步骤4)中，所述kinesin水溶液加入时间为待酪蛋白水溶液加入后5min ; 所述分散液加入时间为述kinesin水溶液加入后5min。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述葡萄糖氧化酶微球或微胶囊为装载聚电解质、蛋白质、多糖或药物的 微球或微胶囊。
6. 权利要求1-5中任一项所述方法制备的葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系。
7. 权利要求6所述葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系在制备纳米器件中的应用。
8. 权利要求6所述葡萄糖响应的微管-驱动蛋白运输体系在作为运输载体中的应用。
【文档编号】C12N11/18GK104152433SQ201410377456
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】李峻柏, 贾怡, 冯熙云, 董伟光, 李洁龄 申请人:中国科学院化学研究所