太空诱变高效灵芝菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一株太空诱变高效灵芝菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。对灵芝菌株进行常规诱变，不仅效率低，且需要对大批量的原始菌株进行诱变，变异幅度较小，很难大规模的提高发酵产物中目的产物灵芝多糖的产率。本发明提供了一株灵芝菌（Ganodermalucidum）S7-T7，可应用于制备抗氧化、提高免疫力的药物和保健品。本发明所述的灵芝菌株与常规育种方法得到的菌株相比，从基因上改变了菌株的遗传特性，弥补了常规诱变所带来的“表型延迟”和“遗传分离现象”，迅速获得高质量的菌株并保证菌株的稳定性，大规模的提高菌株的产率，不需要经过对发酵条件进行大规模优化实验的途径来提高产量。
【专利说明】太空诱变高效灵芝菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及一株太空诱变高效灵芝菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]灵芝，是担子菌纲多孔菌科灵芝属的一种药用真菌。中国古代把灵芝列为上品药物，药物专著《神农本草经》中记载:灵芝有紫、赤、青、黄、白、黑六种，性味甘平。
[0003]现代药理研究证明，灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤作用、保肝解毒作用、扩张冠状动脉和改善心肌微循环作用镇静作用、抗衰老作用、抗神经衰弱作用等。化学成分分析显示，灵芝属的子实体、菌丝体和孢子中含有多糖类、核苷类、呋喃类衍生物、留酵类、生物碱类、蛋白质、多肽、氨基酸类、三萜类、倍半萜、有机锗、无机盐等。
[0004]大量实验研究证明，灵芝的有效成分主要是多糖类物质，灵芝多糖具有免疫调节，抗肿瘤，抗衰老，清除氧自由基，活血化瘀，抗凝血，降血糖及护肝的功效。灵芝多糖通过增强机体免疫力间接抑制肿瘤细胞生长或者诱导肿瘤细胞凋亡，有效的抑制肿瘤生长，呈现一定的抗肿瘤作用。
[0005]提高灵芝菌株中的灵芝多糖含量一直是科研工作者的研究目标，目前主要运用反馈抑制理论构建耐灵芝多糖反馈抑制的筛选模型和应用常规诱变技术来提高灵芝菌株中灵芝多糖产量。利用耐灵芝多糖反馈抑制的筛选模型，筛选及优化菌株发酵过程中所需条件，过程繁琐，不能从根本上对菌株进行改造，产率的提高有限。而对菌株进行常规诱变，例如紫外或者微波诱变等，效率低，如想获得高效率的灵芝菌株，需要对大批量的原始菌株进行诱变，且该方法筛出的菌株的变异幅度较小，很难大规模的提高发酵产物中目的产物灵芝多糖的产率。此外常规诱变会发生“表型延迟”效应，即当代菌株并不表现出产量提高的优点，不能及时对其进行选育，易被丢弃，并且易发生“遗传分离现象”，即突变株并不稳定，不能长久的用于大规模的灵芝菌株生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一株遗传性更稳定、生长更快、灵芝多糖含量更高的太空诱变高效灵芝菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
[0007]本发明所采用的技术方案是:
太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7,于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4877，其特征在于:
其 18SrDNA 序列为 SEQ ID N0.2。
[0008]所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/maS7-T7在制备药物中的应用。
[0009]所述的太空诱变高效灵芝菌iGanoderma Iucidum^l-rXl在制备保健品中的应用。
[0010]所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制备药物中的应用,其特征在于:其在制备提高免疫力药物中的应用。
[0011]所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制备药物中的应用,其特征在于:
其在制备抗氧化药物中的应用。
[0012]所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于:
其在制备提闻免疫力保健品中的应用。
[0013]所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于:
其在制备抗氧化保健品中的应用。
[0014]所述的太空诱变高效灵芝菌{Ganoderma Iucidum^l-Tl制备胶囊制剂的方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将灵芝菌株在发酵罐中培养7~8 d,发酵液4000 rpm离心15min,收集菌丝体,纯化水洗涤菌丝体2次；
步骤二:洗涤后的菌丝体60°C烘干；` 步骤三:将干菌体粉碎后过80目筛，加入1.0%硬脂酸镁、1.0%卡拉胶，混合均匀后按
0.5g/粒装入胶囊,制成胶囊制剂。
[0015]步骤一中，发酵培养基的配方为:蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 7H20
0.05%、VB1 0.005%、水余量。
[0016]本发明具有以下优点:
本发明所述的灵芝菌株与常规育种方法得到的菌株相比，从基因上改变了菌株的遗传特性，弥补了常规诱变所带来的“表型延迟”和“遗传分离现象”，迅速获得高质量的菌株并保证菌株的稳定性，大规模的提高菌株的产率，不需要经过对发酵条件进行大规模优化实验的途径来提高产量，而且所述菌株中灵芝多糖的含量大幅度提高，能够用于进行大规模的生产，用于制备增强免疫力和抗氧化的药物和保健品。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1示地面对照菌株高倍镜观察照片；
图2示本发明所述灵芝菌株高倍镜观察照片；
图3示地面对照菌株结晶紫染色照片；
图4示本发明所述灵芝菌株结晶紫染色照片；
图5示地面对照菌株扫描电镜照片，放大倍数5000 ；
图6示本发明所述灵芝菌株扫描电镜照片，放大倍数5000 ；
图7示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的Vl可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图8示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V2可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图9示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V3可变区；A:地面对照菌株；B:本发明所述灵芝菌株；
图10示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V4可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图11示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V5可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图12示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V6可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图13示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V7可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图14示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA二级结构的V8可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图15示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株的18S rDNA 二级结构的V9可变区；A:地面对照菌株:本发明所述灵芝菌株；
图16示地面对照菌株和本发明所述灵芝菌株SDS-PAGE分析结果泳道 1:分子量 Marker ;从上至下依次为 97.2kDa、66.4kDa、44.3kDa、29.0kDa,20.lkDa、14.3kDa ；
泳道2:地面对照菌株裂解物；
泳道3:本发明所述灵芝菌株第I代菌体裂解物；
泳道4:本发明所述灵芝菌株30代传代菌体裂解物。
【具体实施方式】
[0018]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0019]本发明所述的一株太空诱变高效灵芝菌、Ganoderma lucidum') S7-T7,于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所,建议分类命名为灵芝(Ganochrma lucidum),保藏编号为CGMCC N0.4877。
[0020]下述内容中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
[0021]一、筛选培养:
本发明所述的灵芝菌iGanoderma lucidum),是一株利用神舟七号载人航天器将待突变的地面对照菌株S7-D7 (保藏编号为CGMCC 5.0706)带上太空，经诱变使生物基因组DNA的碱基产生变异，并造成DNA的断裂和重组，产生基因突变。然后在地面进行筛选，比较空间诱变获得的20株单克隆菌株菌丝日生长长度和液体培养菌体干重后，获得的一株有利、高效的正突变菌株。其具体筛选过程如下:
1、培养基
PDA 液体培养基:马铃薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, VB1 0.01 g/L ；
PDA 固体培养基:马铃薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 3.0 g/L7VB1 0.01 g/L，琼脂 20.0 g/L。[0022]2、空间诱变
2008年9月，将待突变的地面对照菌株S7-D7分为2份，1份作为对照菌株于4°C保存，1份搭载神舟七号载人航天器进行空间诱变。
[0023]3、诱变菌株筛选
每50mL试管接入15mL左右PDA固体培养基制成斜面，挑取经空间诱变获得的单克隆S7-T7菌株20株，分别接种于试管斜面上，于25 °C恒温培养5 d，在菌丝生长前沿做标记，继续培养72 h，游标卡尺测量日生长长度。从固体培养基中挑取上述20株单克隆菌株，分别接种于含50 mL PDA液体培养基的250 mL三角瓶中，25°C恒温培养7 d，12000 rpm离心，收集菌体，70°C恒温干燥24 h，分别称取菌体干重。试验重复三次，取平均值，试验过程中地面对照菌株S7-D7作为对照，结果如表1所示。
[0024]表1空间诱变菌株生长速度的测定结果
【权利要求】
1.太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma7wcii//7?)S7-T7,于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4877，其特征在于:
其 18SrDNA 序列为 SEQ ID N0.2。
2.权利要求1所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloiferaaS7-T7在制备药物中的应用。
3.权利要求1所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7在制备保健品中的应用。
4.根据权利要求2所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于: 其在制备提高免疫力药物中的应用。
5.根据权利要求2所述的太空诱变高效灵芝菌7mii/_)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于: 其在制备抗氧化药物中的应用。
6.根据权利要求3所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于: 其在制备提闻免疫力保健品中的应用。
7.根据权利要求3所述的太空诱变高效灵芝菌7mii/?)S7-T7在制备药物中的应用，其特征在于: 其在制备抗氧化保健品中的应用。
8.利用权利要求1所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7制备胶囊制剂的方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:将灵芝菌株在发酵罐中培养7~8 d,发酵液4000 rpm离心15min,收集菌丝体,纯化水洗涤菌丝体2次； 步骤二:洗涤后的菌丝体60°C烘干； 步骤三:将干菌体粉碎后过80目筛，加入1.0%硬脂酸镁、1.0%卡拉胶，混合均匀后按0.5g/粒装入胶囊,制成胶囊制剂。
9.根据权利要求8所述的太空诱变高效灵芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7制备胶囊制剂的方法，其特征在于: 步骤一中，发酵培养基的配方为:蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%>MgSO4.7H20 0.05%、VB1 0.005%、水余量。
【文档编号】A61K36/074GK103548556SQ201310217079
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年6月4日 优先权日:2013年6月4日
【发明者】赵恒
申请人:神舟太空产品高科技成果推广中心集团有限公司