(浓度为40% )前后，色氨酸溶液的荧光光谱如图2所示，可见荧光强度基本不变（虽然浓 度已经下降一半）。本发明专利依据此现象进行下箴刺桐碱的荧光定量，且实验过程中发 现，在测量线性关系1时，不减去空白对照值时线性关系较好；在测量线性关系2时，减去空 白对照值时线性关系较好。具体操作如下。
[0070] 实施例1
[0071] 1.绘制色氨酸标准曲线
[0072] 配制10mg/L的色氨酸标准溶液；取6只试管，一只作为空白对照，另外5只分别滴 加1 μ L、2 μ L、3 μ L、4 μ L、5 μ L的色氨酸标准溶液；分别滴加100 μ L的ρΗ7· 4磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲溶液；用蒸馏水定容至lml，分别测定其荧光强度（激发波长280nm，发射 波长350nm)，结果如表1所示，空白对照组（蒸馏水）的荧光强度Z。= 489 ;以色氨酸质量 浓度A为横坐标，减去空白后的相对荧光强度T'为纵坐标，绘制出色氨酸标准曲线，结果 如图3所示。
[0074] 表 1
[0075] 2标准混合溶液配制
[0076] 配制10mg/L的色氨酸标准溶液与10mg/L的下箴刺桐碱标准溶液；取25只试管， 按表2所示浓度滴加两种标准溶液，计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱 质量浓度B的比值U (该浓度为定容到ImL后的浓度）。
[0079] 表 2
[0080] 3.测定
[0081] 表2各试管分别滴加 pH7. 4的100 μ L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液；用蒸馏 水定容至lmL，分别测定其焚光强度X (激发波长280nm，发射波长350nm);把测定色氨酸标 准曲线时的空白试管并入表2试管组（共26只细管），在26只试管中分别滴加 ImL甲醛 (浓度为40 % )，静置1小时，再分别测定其荧光强度Y (激发波长280nm，发射波长350nm)。 测定所得荧光强度数据如表3所示。空白对照组的荧光强度X。= 489, Y。= 515。
[0084] 表 3
[0085] 4.线性关系曲线1的绘制
[0086] 计算每只试管添加甲醛前后的测量值之比W ;以W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐 碱的质量浓度之比（U)为纵坐标，得线性关系曲线1，如图4所示。
[0087] 5.线性关系曲线2的绘制
[0088] 25只试管中色氨酸质量浓度对应的荧光强度值记为Z，计算出减去空白值后的此 值Z'与减去空白值后不添加甲醛的荧光强度值X'之比V ;以每只试管添加甲醛前后的测 量值之比W'为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2,如图5所示。计算数据如表4所 不。
[0091] 表 4
[0092] 6.公式
[0093] 记前后两次测量值为X，Y ;前后两次测量的空白值为X。，Υ。
[0094] 记色氨酸标准曲线线性方程为
[0095] T1 = mA+n
[0096] 记线性关系曲线1的线性方程为
[0097] U = kff+j
[0098] 记线性关系曲线2的线性方程为
[0099] V = pff ; +q
[0100] 则下箴刺桐碱的浓度P为
[0101] P = [V (X - X0) - n] /mU
[0102] 即
[0104] 其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度， X。、Yc分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度。P的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时 A的单位相同。
[0105] 在本实施例中
[0107] P的单位为yg/L。
[0108] 7.对未知溶液的测定
[0109] 取未知溶液900 μ L，滴加100 μ L的pH7. 4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，试 测其荧光强度X(本发明适用荧光强度范围为1000至4000)，若强度过高，可进行适当的稀 释，之后再取900 μ L，添加100 μ L的pH7. 4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液进行测量； 滴加 ImL甲醛（浓度为40% )，静置1小时后测定其荧光强度Y ;滴加甲醛前后的空白对照 值分别为Yc;直接由公式计算出下箴刺桐碱的浓度。
[0110] 把色氨酸标准液与下箴刺桐碱标准液配制成若干比例不同的混合液，用本发明方 法进行测量，平均回收率为98%。
[0111] 实施例2
[0112] 彩色豆马勃菌丝浸出液中的下箴刺桐碱与色氨酸含量测定
[0113] 彩色豆马勃是一种能合成下箴刺桐碱的真菌，其浸出液先经氯仿与乙酸乙酯萃 取，去除吲哚乙酸。取水相900 μ L，滴加100 μ L的pH7. 4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲 溶液后，进行试测（激发波长280nm，发射波长350nm)，测得荧光强度为X = 3081，位于本 发明的适用范围。滴加 ImL甲醛后，静置1小时，测得荧光强度Y = 2013。空白对照X。= 419, Υ。= 525 ;代入公式可得，刺桐碱的浓度为38. 71 μ g/L，在900 μ L待测液中的质量为 3. 87X10 V
[0114] 以上实施例中的测量均采用日立F-7000荧光分光光度计，电压450V，狭缝10nm。 考察共存离子对i〇yg/L浓度的下箴刺桐碱与色氨酸的影响，当相对误差在±5%的范围 内，共存离子允许量（μ g/L) :Cu2+ (2)、Fe3+ (36)、Mn2+ (75)、Na+ (4000)、Mg2+ (2500)、Κ+ (4000)、 Ca2+(1250)、Zn2+(3000)、Cl- (2800)、SO42- (5000)、CO32- (4000)。吲哚乙酸的荧光光谱与 下箴刺桐碱、色氨酸相似，会严重影响测量，可通过乙酸乙酯萃取去除。酪氨酸与苯丙氨酸 均有天然焚光，但酪氨酸与苯丙氨酸的焚光比色氨酸弱，且焚光发射峰非350nm，在本发明 方法的测量范围内，与待测色氨酸浓度相似的这两种氨基酸不会影响测量。其他的氨基酸 无天然荧光，不影响测量。对于其他的常见物质，只要没有天然荧光，一般不会对本发明方 法造成影响。
【主权项】
1. 一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，其特征在于：包含如下步骤： 1) 配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线； 2) 配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度，绘制 混标准合液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B 的比值U 3) 线性关系曲线1的绘制 4) 线性关系曲线2的绘制 5) 推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式 6) 下箴刺桐碱溶液浓度的确定。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中配制一定浓度梯度的色氨酸溶 液，测定其荧光强度，以浓度值为横坐标，对应各浓度值的荧光强度为纵坐标绘制色氨酸溶 液标准曲线。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中配制色氨酸标准溶液与下箴刺 桐碱标准溶液，并按一定体积比混合，计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐 碱质量浓度B的比值U并记录。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中测定标准混合溶液的荧光强度 X，空白对照组（蒸馏水）的荧光强度为在试管中分别滴加甲醛，静置1小时，再测定添 加甲醛后的混合溶液的荧光强度Y，空白对照组（蒸馏水中滴加甲醛）的荧光强度为Y。， ff=Y/X(1) 式中W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的质量浓度之比（U)为纵坐标，得到线性关系 曲线1。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中使用步骤2)试管中色氨酸质 量浓度在步骤1)中对应的荧光强度值记为Z，空白对照组如蒸馏水的荧光强度为Z。，计算 减去空白值后的此值Z'与减去空白值后的不添加甲醛的色氨酸荧光强度值X'之比V，以 每只试管添加甲醛与不添加甲醛的测量值之比W'为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲 线2 ; 步骤5)中色氨酸标准曲线线性方程为?' =mA+n(2) 线性关系曲线1的线性方程为U=kff+j(3) 线性关系曲线2的线性方程为V=pff;+q(4) 推导下箴刺桐碱的浓度P的计算公式为P= [V(x-X〇) -n]/mU(5) 即：其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度，XD、YD 分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度，P的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A的单 位相同，p的单位为μg/L。公式（6)的建立。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)中取1份体积的待测下箴刺桐碱 溶液，加9份pH7. 4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，试测此稀释液的荧光强度，荧光强 度应在1000至4000范围内，若荧光强度过高，可再适当稀释，并记录稀释倍数；测得合适 的荧光强度X后，按步骤5)中的公式计算出稀释后下箴刺桐碱溶液的浓度，再根据稀释倍 数，计算出原溶液中下箴刺桐碱的浓度。
【专利摘要】本发明公开了在色氨酸杂质存在条件下一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，包含如下步骤：配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线；配制色氨酸与下箴刺桐碱混合标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度，绘制标准混合溶液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度，线性关系曲线1的绘制，线性关系曲线2的绘制，推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式，确定下箴刺桐碱溶液浓度，该方法能在色氨酸杂质存在条件下直接用荧光光谱法定量下箴刺桐碱的荧光量，避免色氨酸杂质对测试结果的影响，本法前处理时间短、检测成本低、能快速大批量检测。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105300946
【申请号】CN201510779510
【发明人】陆祖军, 刘祎, 李云飞, 梁士楚
【申请人】广西师范大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月12日