一种荧光光片显微成像系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种显微镜系统，特别是涉及一种荧光光片显微成像系统及方法。
【背景技术】
[0002] 1993 年，Voie A. H.等人发明 了光片显微镜（Orthogonalplane Fluorescence Optical Sectioning，0PF0S)，它使用片层光横向照明透明生物组织，从而实现生物组织不 同深度的显微成像。但由于当时的成像分辨率较低，且不能用来做活细胞测量，未在随后 的十年中得到应用。直到2004年，Huisken J.和Stelzer E.H.等人应用圆柱形透镜将入 射激发光通过入射物镜聚焦到样本上并形成静态高斯光片，然后通过高数值孔径荧光物镜 观测，建立了第一代静态焚光光片显微镜（Selective Plane Illumination Microscopy， SP頂)，并在之后的活体荧光成像中得到了应用。但是，第一代静态荧光光片显微镜的主要 缺点是构造的光片厚度在8~10微米且不均匀，不能够做定量测量，且在成像组织深层时 图像对比度下降很快。2008年，Keller P.J.和Stelzer E.H.等人发明了第二代扫描型 荧光光片显微镜。在该显微成像系统中，入射激发光通过管透镜和入射物镜在样本中形成 一条聚焦的线，通过扫描反射镜和f-theta物镜使得聚焦光线在组织平面一维快速扫描， 从而产生一个虚拟的光片，产生的受激发射荧光经由高数值孔径荧光物镜和中继透镜被超 高灵敏度C⑶(Electron-Multiplying C⑶，EM(XD)记录，被称为数字扫描型荧光光片显微 镜（Digital Scanned Light Sheet Microscopy，DSLM)。随后 2010 年，Keller P.J.等人 发明了将结构光照明（Structure Light Illumination，SIM)引入扫描型焚光光片显微镜 中，提高了显微成像的空间分辨率，并观察到两种颜色标记下的细胞核和细胞膜动态变化。 2012年，Tomer R.等人发明了改进型的荧光光片显微镜系统，它通过左、右两侧物镜同时照 明来产生更均匀的激发光片，并在样本的上、下两侧分别使用观测物镜尽可能多地收集受 激发射荧光信号。运用上述扫描光片显微镜，近几年国内外多个研究机构开展了细胞生物 学、发育生物学以及神经科学的活体成像研究。
[0003] 由于荧光光片显微镜原理上是2D成像，其成像时间分辨率要显著优于共聚焦显 微镜和双光子显微镜的时间分辨率。但是，荧光光片显微镜的空间分辨率会受到对激发光 片的厚度限制以及成像组织的深度限制，使其低于共聚焦显微镜和双光子显微镜的空间分 辨率。2014年，Eric B.和Kai W.等人提出了基于成像视场各等晕区内波前畸变传感和校 正的双光子荧光显微镜，使得清晰成像组织的深度达到了 200多微米。但是，不同于逐点扫 描模式的双光子显微镜，逐层扫描模式的光片显微镜并不适用上述的波前畸变传感和校正 方法。为此，需要研究适用于大视场、高时空分辨率、深层生物组织的荧光光片显微镜的新 型波前畸变传感和校正方法。
[0004] 因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的至少一个上述缺陷。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种荧光光片显微成像系统及方法来克服或至少减轻现 有技术中的至少一个上述缺陷。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种荧光光片显微成像系统，所述荧光光片显微成 像系统包括检测装置、校正装置、成像装置和控制装置，其中：所述检测装置用于检测活体 样本内部的组织平面成像视场的各预设等晕区的波前像差畸变，并输送给所述控制装置， 所述控制装置用于根据接收到的所述波前像差畸变，向所述校正装置发出校正指令，所述 校正装置用于根据接收到的所述校正指令，对各所述等晕区同时进行至少一次波前校正， 所述成像装置用于对波前校正后的所述组织平面成像。
[0007] 进一步地，所述校正装置至少包括第一校正器和第二校正器，其中：所述第一校正 器用于波前校正所述各等晕区的波前像差畸变相同部分，所述第二校正器用于波前校正所 述各等晕区的波前像差畸变差异部分。
[0008] 进一步地，所述检测装置至少包括荧光激发单元、第一波前传感器和第二波前传 感器，其中：所述荧光激发单元可操作地向所述组织平面照射激发光或点，所述第一波前传 感器用于接收所述组织平面经所述激发光照射后产生的受激发射荧光，并检测出该荧光位 于所述各等晕区时的波前像差畸变，所述第二波前传感器用于接收并检测经由所述第一校 正器波前校正后的所述各等晕区的剩余波前像差畸变。
[0009] 进一步地，所述检测装置还包括第一位置调整单元和第二位置调整单元，所述第 一位置调整单元和所述第二位置调整单元依次设于所述荧光激发单元和所述成像装置之 间，并用于调整所述激发光照射在所述组织平面上的光斑位置。
[0010] 进一步地，所述成像装置包括载物台、片光照明单元、显微物镜、会聚透镜和图像 探测器，其中：所述载物台用于支承所述活体样本，且界定了所述活体样本的轴线以使大致 安置在所述轴线上的样品成像；所述片光照明单元可操作以在与所述活体样本相交的所述 组织平面内产生激发片层光；所述显微物镜和会聚透镜用于对波前校正后的所述组织平面 放大成像在显微成像面，所述图像探测器的探测面与所述显微成像面重合。
[0011] 进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第一远心成像光路和第二远心成像 光路，所述第一远心成像光路具有第一出曈面和第二出曈面，所述第二远心成像光路具有 第三出曈面和第四出曈面，所述第一出曈面设所述显微物镜的后出光端面，所述第三出曈 面与所述第二出曈面垂直相交且交点处设所述第一位置调整单元，所述第四出曈面设所述 第二位置调整单元。
[0012] 进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第三远心成像光路和第四远心成像 光路，所述第三远心成像光路具有第五出曈面和第六出曈面，所述第四远心成像光路具有 第七出曈面和第八出曈面，所述第五出曈面与所述第四出曈面垂直相交且交点处设所述第 二位置调整单元，所述第七出曈面与所述第六出曈面相交且交点处设所述第一校正器，所 述第八出曈面设所述第一波前传感器。
[0013] 进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第五远心成像光路和第一透/反切 换器，所述第五远心成像光路具有第九出曈面和第十出曈面，所述第一透/反切换器位于 所述第四远心成像光路中，并用于使所述荧光经所述第一透/反切换器能够透射到达所述 第一波前传感器以及使所述荧光或所述激发片层光经所述第一透/反切换器能够反射到 达所述第四远心成像光路的另一所述第八出曈面，所述另一第八出曈面后方预设距离的所 述第九出曈面设所述第二校正器，所述第十出曈面设所述第二波前传感器。
[0014] 进一步地，所述荧光光片显微成像系统还包括第二透/反切换器，所述第二透/反 切换器位于所述另一第八出曈面在所述第五远心成像光路中的像面上，并用于使所述荧光 经所述第二透/反切换器能够透射到达所述第二波前传感器以及使所述激发片层光经所 述第二透/反切换器能够反射到达所述图像探测器。
[0015] 进一步地，所述图像探测器沿其光轴前后移动能够接受并检测所述第二透/反切 换器所在的出曈面的波前像差畸变，该波前像差畸变也可由所述第一校正器进行波前校 正。
[0016] 进一步地，所述第一远心成像光路的第一透镜、第二远心成像光路、第三远心成像 光路和第四远心成像光路的焦距均为f，所述第五远心成像光路的焦距均为I. 5f，所述另 一第八出曈面与所述第九出曈面的预设距离为0. 5f，所述第二透/反切换器与所述另一第 八出曈面的距离为6f，所述第一远心成像光路、第二远心成像光路、第三远心成像光路、第 四远心成像光路和第五远心成像光路还分别具有像面、出曈面以及后出瞳面，各所述像面 成共辄关系，各所述出曈面成共辄关系，各所述后出曈面成共辄关系。
[0017]