荧光成像的系统和方法
【专利摘要】一种生成印迹膜图像的仪器，包括内腔、光源、光学系统、光检测器和分光器。内腔支撑印迹膜，其包含一个由激发波长和发射波长表征的第一探针以及一个由激发波长和发射波长表征的第二探针。光源引导发散光线的方向，以照亮整体活性区域。光学系统形成整体活性区域的图像，包含一个滤光器,该滤光器具有高度透射发射波长光线和高度反射激发波长光线的光学特征。分光器可具有高度透射第一和第二发射波长光线和高度反射第一和第二激发波长光线的光学特征。
【专利说明】荧光成像的系统和方法
[0001] 相关申请
[0002] 根据35 U.S.C§ 119(e)，本申请享有于2012年5月9日提交的第61/644,968号 临时申请的优先权，本申请提及的所有文件，虽仅提到其名称，却视同全文引用，纳入此申 请书中。
[0003] 发明背景
[0004] 发明领域
[0005] 本发明与生物样本的光学系统和方法有关，特别与生物样本二维分布荧光成像的 光学系统和方法有关。
[0006] 相关领域描沐
[0007] 荧光读数仪和成像设备被用于识别蛋白质、DNA或RNA分子等各种生物分子物质。 包含这类分子的样本可根据各种已知程序、方案或化验进行制备。样本中的分子可使用本 领域中已知的各种吸光、放射性、发光或荧光化合物进行检测、分析和/或区分。例如，可将 荧光探针、染料、标记物等一种或多种荧光团加入样本中以产生荧光信号或图像指示，表明 一种或多种目标分子的存在或数量。
[0008] 检测或成像的程序可包括分离物种报告器部分的附件。这种程序的实例包括印迹 膜的使用。根据所关注生物分子类型的不同，可能会使用"南方"、"北方"和"西方"印迹程 序。例如，"西方"印迹一般在蛋白质分子检测或测量中使用。
[0009] 一般的仪器昂贵且复杂。需要系统和方法，通过最低限度的培训得到试验结果。此 夕卜，还需要低成本系统使这些技术可以向台式用户推广。量子点系统很有吸引力，但目前缺 乏低成本的专用设备用于"西方"印迹检测和细胞分析。因此，同样也需要简单、廉价的"西 方"印迹系统和方法。
[0010] 图纸的简要说明
[0011] 本发明的各方面、特征和优点在以下说明书和权利要求中阐明，特别结合附图加 以考虑，图中类似的零件使用类似的参考编号。结合附图，通过下列详细描述可更好地理解 本发明的实施例。这些实施例仅用于说明目的，描述本发明的新颖性和非显著性方面。附 图包括下列各图：
[0012] 图1是根据本发明一个实施例的系统示意图。
[0013] 图2是图1中所示类似系统的各种实施例表格。
[0014] 图3是根据本发明一个实施例的系统照片。
[0015] 图4是使用图3所示的系统得到的检测结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 本发明的实施例一般针对从含有一种或多种焚光染料、标记物或探针的样本取得 荧光数据的系统和方法。这些实施例可包括记录底物荧光图像的成像系统或仪器，底物包 括蛋白质、DNA和/或RNA分子等。在某些实施例中，系统和方法含有适合使用印迹法检测 和测量蛋白质、DNA和/或RNA的底物样本。实例包括但不限于"西方"印迹、"南方"印迹、 "北方"印迹、"东方"印迹、反式"北方"印迹、"远西方"印迹、点印迹、狭缝印迹等。
[0017] 参考图1，在某些实施例中，仪器、装置或系统100包含一个外壳102,并且经过配 置生成一个或多个生物分子样本104的两维分布图像，该样本位于一个隔间、隔室、空腔或 内腔106中。系统100还包含一个激发源或光源108、一个光学系统110和一个分光器112， 它们一起经过配置以生成样本104的图像，图像由一个光传感器或光检测器114接收以产 生一个电子信号。系统100进一步可包含一个控制器、处理器、计算系统或计算机118,其经 过配置以操作系统100和/或收集或记录来自样本104的数据。
[0018] 计算机118可包括电子存储器，其含有存储指令、例程、算法、检测和/或配置参 数、检测或试验数据等。例如，可对计算机118进行配置以操作光学系统的各种部件，或者 取得和/或处理由系统100提供的数据。例如，计算机118可用于取得和/或处理由光检测 器114提供的光学数据。在某些实施例中，计算机118可与附加的外部计算机通讯，并且/ 或者将数据传输到外部计算机以进行进一步处理，例如使用硬线连接、局域网、云计算系统 等完成传输。计算机118可以是物理计算机，例如台式计算机、笔记本计算机、平板计算机 等。另外或作为选择，计算机118可包括一个虚拟设备或系统，例如云计算或存储系统。数 据可在计算机118与外部计算机之间通过无线连接在局域网、云存储或计算系统等内部共 享。另外或作为选择，来自系统100的数据可传输到外部存储设备，例如外部硬盘、USB存 储模块、云存储系统等。
[0019] 内腔106可经过配置以支撑或固定样本104,例如通过内腔106中提供的底板、基 础、台架、底座等。样本104还可包含在样本架120之上或之内，其包括一个活性区域122 并在内腔106中得到支撑或固定。本文所用的术语"活性区域"是指包含需要取得图像和 /或信息的一个或多个样本的样本架的一个部分或区域。样本架120可包含基底、凝胶、膜 或其他适合固定或保持样本104的结构或材料。
[0020] 在某些实施例中，一个或多个样本104包括荧光基团，例如荧光探针、荧光染料、 荧光标记物等。例如，一个或多个样本104可包含一个由第一激发波长（或波段）和第一 发射波长（或波段）表征的第一荧光探针以及由第二激发波长（或波段）和第二发射波长 (或波段）表征的第二荧光探针。在某些实施例中，任何或所有特征波长可以是波段的平 均或中值波长，或者是在波段上最大值处的波长。每个荧光探针可进行配置，在与样本104 中存在的每个荧光探针的对应预定化学序列结合时被激活或提供增加的荧光。预定的化学 序列可包括一个以上的多核苷酸、氨基酸序列、DNA序列、RNA序列等。样本可进一步包含额 外的荧光探针等，其中每个荧光探针可进行配置，在与样本104中存在的每个荧光探针的 对应预定化学序列结合时被激活或提供增加的荧光。预定的化学序列可包括仅一种类型的 序列（例如包含仅氨基酸序列、仅DNA序列或仅RNA序列）或可包含不同类型序列的组合 (例如一个或多个氨基酸序列和一个或多个仅DNA和/或仅RNA序列）。在某些实施例中， 一个或多个样本104包括一种或多种类型的纳米晶体探针材料或量子点探针材料。这些材 料可用作前文中讨论的荧光探针的替代或补充。有利的是，在以上讨论的各种应用中，相对 于更传统的荧光基团，可使用这样的材料提高灵活性和/或信号强度。
[0021] 在某些实施例中，样本架120包含一个印迹膜或基底或类似结构，用于进行包括 纳米晶体、量子点和/或其他荧光染料或探针在内的印迹化验。在这些实施例中，样本104 可包括一个或多个目标肽或蛋白质序列，活性区域122可包含蛋白质免疫印迹、"西方"印迹 或点印迹。另外或作为选择，样本104可包括一个或多个目标DNA和/或RNA序列，并且/ 或者活性区域122可包含"南方"印迹、"北方"印迹、"东方"印迹等。
[0022] 在图1所示的实施例中，内腔106包含一个第一内壁123、一个第二内壁124、一个 第三内壁125和一个第四内壁126。第一内壁123和第三内壁125是被布置在内腔106对 侧的侧壁。第二内壁124是顶壁，包括活性区域122上方的一个狭缝130,其提供活性区域 122与光检测器114之间的光路。第四内壁126被布置在内腔106底部，位于样本架120下 方。光源可被布置在第三内壁125上，如图1所示。在这些实施例中，第三内壁125距离分 光器112可比第一内壁123更远。此外，对于所示的实施例，第三内壁125距离分光器112 可比第二内壁124更远。有利的是，由于第三内壁125与分光器112的距离更大，其位置使 光源108的散射光束可以充满整体活性区域122。另外或作为选择，第三内壁125可包含一 个窗口或狭缝，以便光源108可安装在外壳102的外侧。
[0023] 光源108包含电磁辐射，其位于适合激发样本104中所含荧光染料或探针的波段 中。本文所用的术语"光源"是指任何可见光波段、紫外波段、近红外波段和/或红外波段 电磁辐射的来源。光源的示例包括但不限于发光二极管（LED)、激光、氙灯、卤素灯、汞灯、 紫外灯和/或白炽灯。在图1所示的实施例中，光源108经过配置以沿着第一光轴140引 导发散光束，从而照亮整体活性区域122。光源108可包含一个波长谱，其包括第一激发波 长和第二激发波长，以及对应于样本104所含其他可选目标序列对应荧光团的任何激发波 长。有利的是，系统100经过配置，以便整体活性区域122同时由光检测器114照射和成像。 在某些实施例中，光源108包含多个单独的光源，例如LED光源阵列，其中至少一些LED具 有不同的颜色或不同的发射波段。
[0024] 光检测器114可包含一个二维分区或像素化的探测器阵列。例如，光检测器114 可包含一个二维电荷耦合器件（CXD)检测器或二维互补金属氧化物半导体（CMOS)检测器。 光检测器114经过配置以接收由样本104所含一个或多个荧光染料或探针产生的一个或多 个图像。
[0025] 除分光器112外，光学系统110还可进一步包含一个或多个透镜142,其经过配置 以使活性区域122在光检测器114上成像，以及至少一个发射滤光器144,其经过配置以过 滤来自光源108的激发光。位于样本104与光检测器114之间的光学系统110的元件沿着 第二光轴148布置，其在所示的实施例中与第一光轴140垂直。
[0026] 滤光器144可具有高度透射样本104中所含一种或多种焚光染料或探针发射波长 的光学特征。例如，滤光器144可具有在样本104中所含一种或多种荧光染料或探针所产 生发射波长上透射率至少90%、至少99 %或至少99. 9 %的光学特征。滤光器144的光学特 征可同时高度反射和/或高度吸收其他波长的光线（例如，在光源108的所有或大部分发 射波长上高度反射或吸收）。例如，滤光器144可具有在样本104中所含一种或多种荧光染 料或探针所产生发射波长外至少90%、至少95%、至少99 %或至少99. 9 %的反射率或吸光 率。滤光器144可具有高度透射样本104中两种或更多荧光染料或探针发射波长的光学特 征。例如，滤光器144可具有在样本104中两种或更多荧光染料或探针所产生发射波长上 至少90 %、至少95 %、至少99 %或至少99. 9 %的透射率。或者，滤光器144可具有高度透 射样品104中仅一种所含荧光染料或探针发射波长的光学特征。在这些实施例中，光学系 统可包含多个发射滤光器144,可将它们移入或移出样本104发射光的光路。在这些实施例 中，可使用光检测器114记录样本104的一系列图像，其中不同的图像记录样本104中所含 荧光染料或探针或者样本104中所含不同荧光染料或探针组之一。
[0027] 在图1所示的实施例中，分光器112具有高度透射样本104中所含荧光染料或探 针发射波长的光线的光学特征。例如，分光器112可具有在样本104中所含一种或多种荧 光染料或探针所产生发射波长上至少90%、至少99 %或至少99. 9 %的透射率。此外，分光 器112的光学特征可高度反射与光源108波段或谱带对应的波长的光线和/或高度反射适 合激发样本104中所含荧光染料或探针的波长的光线。例如，分光器112可具有在样本104 中所含一种或多种荧光染料或探针所产生发射波长上至少90%、至少99%或至少99. 9% 的反射率。为实现这些光学特征，分光器112可以是一个二向色分光器或反射镜。在某些 实施例中，发射滤光器144和分光器112的组合在降低使用光检测器114记录的样本图像 中非荧光光线噪声方面有利且非常有效，因为这种非荧光光线经过两次过滤一一由分光器 112进行一次，然后由发射滤光器144进行一次。在某些实施例中，可使用分光器112进一步 降低来自非荧光光线的噪声，以便将内腔106分隔成两个隔离的腔室或封闭体150和152， 这样很少或没有分光器反射波长的光线进入封闭体150。
[0028] 在某些实施例中，光源108和样本104面对面位于分光器112的对侧。在这些实 施例中，样本104经过配置使来自样本104的荧光光线从分光器112反射出来并进入检测 器114。应当认识到，在这些实施例中，分光器112可具有高度反射104样本所含荧光染料 或探针发射波长的光线的光学特征。此外，分光器112的光学特征在这种情况下可高度透 射与光源108波段或谱带对应的波长的光线和/或高度透射适合激发样本104中所含荧光 染料或探针的波长的光线。
[0029] 在某些实施例中，光源108是一种单色光源（例如单色LED或激光）并且/或者具 有相对较窄的波段（例如波段小于等于100纳米、小于等于50纳米或小于等于10纳米）。 在这些实施例中，样本104可包括两个或更多类型的量子点染料或探针，其具有相同或接 近相同的激发波长。例如，每个样本104可包含一个具有390纳米激发波长和625纳米发 射波长的第一量子点以及一个激发波长同样为390纳米且发射波长为800纳米的第二量 子点。可使用单个激发滤光器144使来自两个量子点的发射光线通过，例如，在600纳米到 850纳米波段上透射率大于95 %并且在390纳米波长上透射率小于1 %的滤光器（例如，在 600纳米以下波长上具有1 %以下的透射率）。在这些实施例中，分光器112可在与量子点 激发波长相等的波长上具有较高的反射率（例如，在360纳米到420纳米的波长范围上具 有至少95 %或至少99 %的反射率或者在600纳米以下的波长上具有至少95 %或至少99 % 的反射率）并且高度透射量子点的发射波长上的光线（例如，在大于等于600纳米的波长 上高度透射）。
[0030] 参考图2,提供了系统100各类配置的汇总。例如，前面段落中所描述的配置实施 例显示在标为" Qdot "应用的行中。
[0031] 示例
[0032] 参考图3,所示为系统100的一个实施例，其中系统包含一个130万像素的CMOS检 测器和一个图像捕捉电路（Micron)，其配合短焦距平视角镜头（Myutron)安装在一个黑箱 中。使用个人计算机通过USB数据线捕捉TIF格式的图像。通过两种激发和发射组合，使 用激发波长上适当的LED阵列构建两种设备的变型；二向色反射镜配合针对具体应用的透 射和反射带通滤光器，用于Qdot "西方"印迹成像（图3和图4)和DNA定量。
[0033] 对于Qdot检测，安装395纳米发射LED作为激发光源，配有一个420纳米带通二 向色反射镜以及在625纳米和800纳米滤光的发射滤光器。在3个聚丙烯酰胺电泳凝胶 (SDS-PAGE)上分离出一系列牛血清白蛋白（200ng-780pg)，分别在3个硝酸纤维素膜上标 记。然后，使用兔抗牛血清白蛋白进行免疫检测流程。每个膜标为a)625纳米，b)800纳米 荧光发射抗兔量子点结合抗体和c) 一个标为HRP结合抗兔抗体的对照膜。标为Qdot的膜 在试验成像仪中曝光2秒钟，标为HRP的膜进行60秒胶片曝光。两种方法产生牛血清白蛋 白低至〇.4ng的相同检测水平。另外的试验（数据未显示）表明，使用富士 LAS-3000对所 述标为Qdot的2分钟曝光时间膜成像仅比在试验装置中2秒曝光时间成像的相同膜的检 测灵敏度高2倍。图4所示的膜使用图2所述设置的原型及625纳米发射滤光器成像。
[0034] 对于DNA定量，使用480纳米LED光源，以及一个505纳米带通二向色反 射镜和一个530纳米发射滤光器。使用Qubit#荧光计（HS和BR试剂盒制造商为 Invitrogen, Carlsbad, CA)对DNA样本的系列稀释液进行定量分析，然后在96孔微孔板中 培养，并且使用试验成像系统成像。通过图像分析密度定量计算DNA浓度。方法使多个样 本可以得到准确结果的批量分析，图像分析样本的相关性R~2 = 0. 982, QubiM'分析的样本 相关性 R~2 = (λ 961。
[0035] 参考图4所示的结果，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分离出一系列牛血清 白蛋白（200ng-780pg)，在硝酸纤维素膜上标记，然后使用兔抗牛血清白蛋白检测，并且使 用625纳米荧光发射抗兔量子点结合抗体标示。使用图3中所示设置的原型成像仪器对膜 成像。
[0036] 在一个实施例中，在以前主要用于显微镜的大型系统中模块化使用了 LED、二向色 反射镜和滤光器。LED-滤光器和二向色反射镜作为一个单元的模块化也是新的尝试。
[0037] 以上介绍了实现本发明所设想的最佳模式，描述了制造和使用的方式及过程，使 用了全面、清楚、简明、准确的术语，从而使任何与其相关的本领域技术人员都能完成和使 用本发明。然而，本发明易受上述讨论中完全等效的改进和替换结构的影响。因此，目的并 不是将本发明限制于所公开的具体实施例。相反，目的是覆盖所有来自以下权利要求所表 示的本发明精神和范围内的改进和替换结构，其特别指出并明确要求保护本发明的主题。
【权利要求】
1. 一种生成印迹膜图像的仪器，包含： 一个外壳，包含支撑基底的内腔，该基底包括一个印迹膜，印迹膜包含一个活性区域， 活性区域包括一个由第一激发波长和第一发射波长表征的第一巧光探针W及一个由第二 激发波长和第二发射波长表征的第二巧光探针； 一个光源，经过配置W沿着第一光轴引导发散光束，从而照亮整体活性区域，光源包含 一个波长谱，其包括第一激发波长和第二激发波长； 一个沿着第二光轴布置的光学系统，其经过配置W形成整体活性区域的图像，光学系 统包含一个镜头和一个滤光器，滤光器具有高度透射第一和第二发射波长光线W及高度反 射或吸收第一和第二激发波长光线的光学特征。 一个光检测器，经过配置W接收整体活性区域的图像。 一个分光器，位于内腔内部，并且与第一光轴和第二光轴相交； 其中分光器具有高度透射第一和第二发射波长光线W及高度反射第一和第二激发波 长光线的光学特征，或者具有高度透射第一和第二激发波长光线W及高度反射第一和第二 发射波长光线的光学特征。
2. 根据权利要求1所述的仪器，其中第一激发波长等于第二激发波长。
3. 根据权利要求1所述的仪器，其中波长是波段上的平均波长。
4. 根据权利要求1所述的仪器，其中光源包含至少两个具有不同波长或不同波段特征 的单独光源。
5. 根据权利要求1所述的仪器，其中分光器包含一个第一面W及一个与第一面正对的 第二面，内腔包含一个与第一面部分接触的第一封闭空间W及一个与第二面部分接触的第 二封闭空间。
6. 根据权利要求5所述的仪器，其中： 第一封闭空间至少与分光器的第一面、外壳的第一内壁和外壳内壁的第二壁部分接 触； 第二封闭空间至少与分光器的第二面、外壳的第S内壁和外壳内壁的第四壁部分接 触；并且 分光器和至少某些内壁阻断了第一激发波长的光线和第二激发波长的大部分光线进 入第一封闭空间。
7. 根据权利要求6所述的仪器，其中分光器包含与内壁之一接触的第一边缘W及与第 一边缘正对接触内壁之一的第二边缘。
8. 根据权利要求6所述的仪器，其中分光器和至少部分内壁阻断了第一激发波长的光 线和第二激发波长的至少95%光线进入第一封闭空间。
9. 根据权利要求6所述的仪器，其中光检测器被布置在印迹膜上方，经过配置W接收 来自沿着第二光轴的印迹膜的发射光线，第一光轴和第二光轴正交，来自光源的光线沿着 从光源到活性区域的激发光路布置，其大于沿着从活性区域到镜头的发射光路的距离。
10. 根据权利要求6所述的仪器，其中： 内腔包含一个基底和一个放在基底上的印迹膜，印迹膜包含一个活性区域； 第一内壁和第=内壁是被布置在内腔对侧的侧壁，光源被布置在第=内壁上； 第二内壁被布置在内腔顶壁上，第二内壁包括活性区域上方的一个狭缝，其提供活性 区域和光检测器之间的光路； 第四内壁被布置在内腔底部，位于印迹膜下方；并且 第=内壁距离分光器比第一内壁更远，距离分光器比第二内壁更远；
11. 根据权利要求1所述的仪器，其中内腔包含一个基底和一个在被布置在基底上的 印迹膜。
12. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包括一种底物。
13. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包含一种蛋白质免疫印迹。
14. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包含一种"南方"印迹。
15. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包含一种巧光探针材料。
16. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包含一种纳米晶体探针材料。
17. 根据权利要求11所述的仪器，其中印迹膜包含一种量子点探针材料。
18. 根据权利要求1所述的仪器，其中光检测器包含一个二维电荷禪合器件（CCD)检测 器或二维互补金属氧化物半导体（CMO巧检测器。
19. 一种生成印迹膜图像的仪器，包含： 一个外壳，包含经过配置支撑基底的内腔，该基底包括一个印迹膜，印迹膜包含一个活 性区域，活性区域包括一个由第一激发波长和第一发射波长表征的第一巧光探针W及一个 由第二激发波长和第二发射波长表征的第二巧光探针； 一个光源，经过配置W沿着第一光轴引导发散光束，从而照亮整体活性区域，光源包含 一个波长谱，其包括第一激发波长和第二激发波长； 一个沿着第二光轴布置的光学系统，其经过配置W形成整体活性区域的图像，光学系 统包含一个镜头和一个滤光器，滤光器具有高度透射第一和第二发射波长光线W及高度反 射或吸收第一和第二激发波长光线的光学特征； 一个光检测器，经过配置W接收整体活性区域的图像； 一个分光器，位于内腔内部，并且与第一光轴和第二光轴相交； 其中分光器具有高度透射第一和第二发射波长光线W及高度反射第一和第二激发波 长光线的光学特征，或者具有高度透射第一和第二激发波长光线W及高度反射第一和第二 发射波长光线的光学特征；
20. -种印迹膜的成像方法，包含； 提供一个包含一个内腔的外壳，其内腔经过配置W支撑包括一个印迹膜的基材，该印 迹膜包含一个活性区域； 将基材放入内腔中； 将第一巧光探针和第二巧光探针加入活性区域，第一巧光探针由第一激发波长（或波 段）和第一发射波长（或波段）表征，第二巧光探针由第二激发波长（或波段）和第二发 射波长（或波段）表征，其发射波长与第一发射波长的值不同。 沿着第一光轴将来自光源的发散激发光束引导至活性区域，光源包含一个波长谱，其 包括第一激发波长和第二激发波长； 将光束从分光器反射出来，该分光器位于内腔内部，并且与第一光轴和第二光轴相 交； 使用一个沿着第二光轴布置的光学系统形成整体活性区域的图像，光学系统包含一个 镜头和一个滤光器，滤光器具有高度透射第一和第二发射波长光线w及高度反射或吸收第 一和第二激发波长光线的光学特征； 通过将发射光线经分光器和发射滤光器透射，使用光检测器检测整体活性区域图像。
21. -种印迹膜的成像方法，包含； 提供一个包含一个内腔的外壳，其内腔经过配置W支撑包括一个印迹膜的基材，该印 迹膜包含一个活性区域； 将基材放在内腔中； 将第一巧光探针和第二巧光探针加入活性区域，第一巧光探针由第一激发波长（或波 段）和第一发射波长（或波段）表征，第二巧光探针由第二激发波长（或波段）和第二发 射波长（或波段）表征，其发射波长与第一发射波长的值不同； 沿着第一光轴将来自光源的发散激发光束引导至活性区域，光源包含一个波长谱，其 包括第一激发波长和第二激发波长； 通过一个分光器使光束透射，该分光器位于内腔内部，并且与第一光轴和第二光轴相 交； 使用一个沿着第二光轴布置的光学系统形成整体活性区域的图像，光学系统包含一个 镜头和一个滤光器，滤光器具有高度透射第一和第二发射波长光线W及高度反射或吸收第 一和第二激发波长光线的光学特征； 通过将发射光线从分光器反射出来并经发射滤光器透射，使用光检测器检测整体活性 区域图像。
【文档编号】G01N21/64GK104471379SQ201380032592
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2012年5月9日
【发明者】阿里·贾格尔, 贾森·达尔维格, 马修·比欧戴特 申请人:生命技术公司