一种荧光光片显微成像系统及方法_3

文档序号:9545337阅读:来源:国知局
波前传感器12b先、后传感组织平面Al上各等晕区的出瞳面波前畸变和后出瞳面波 前畸变时,由于此时各等晕区均采用双光子点扫描形式激发和成像,各点激发光都会因为 上述扫描形式在经过第二位置调整单元13b后在光路中成为轴上光场成像。此时,结合传 感获得各等晕区的出瞳面波前畸变和后出瞳面波前畸变基于上述卷积形式可以建立离散 光场的超定线性方程组,由此基于最优化算法估计出上述出后出瞳面相对于出瞳面的所有 几何参数,由此修正从第一波前传感器12a到第二波前传感器12b的传感器传播模型1。同 理,使用第一波前校正器21和第二波前校正器22实施分配波前的校正以及使用第一波前 传感器12a和第二波前传感器12b分别传感剩余波前像差畸变分布,同样可以建立针对第 一波前校正器21和第二波前校正器22上离散光场的超定线性方程组进而修正校正器传播 模型2。利用上述两个传播模型可以计算在光片激发光照明下各等晕区在第七出瞳面7a的 任意波前像差畸变传播至第八出瞳面7b、第九出瞳面8a、第十出瞳面8b的实际区域和分布 以及对应传感器上的输出形式和对应校正器上的输入形式。
[0042] 藉由上述原理,本实施方式中的检测装置1至少包括荧光激发单元11、第一波前 传感器12a和第二波前传感器12b,其中:
[0043] 荧光激发单元11可操作地向所述组织平面Al照射激发光或点,荧光激发单元 11具体包括两个不同波长的双光子/多光子激发光光源11a、准直镜Ilb和二向色分光 立方11c,双光子/多光子激发光光源Ila使用近红外高能锁模脉冲激光器,其发出的脉 冲激光(100飞秒)经准直镜Ilb准直后经二向色分光立方Ilc(镀膜为高反低通)反 射至第二位置调整单元13b,再经第一透镜52和第一透镜51至第一位置调整单元13a, 再经第一透镜42和中继透镜41和显微物镜32会聚到组织平面Al上某点,并且该点的 位置可由第一位置调整单元Ila和第一位置调整单元Ilb电动二轴控制。同时可通过 TTL (Transistor-Transistor Logic,逻辑门电路)信号精确控制上述双光子/多光子激发 光光源Ila的开关时序。
[0044] 第一波前传感器12a用于接收组织平面Al经所述激发光照射后产生并传播到出 瞳面的受激发射焚光,并根据Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法计算出该焚光在所述各 等晕区的波前像差畸变。第二波前传感器12b用于接收并根据Shack-Hartmann(S-H)波前 传感算法计算经由第一校正器21波前校正后的所述各等晕区的剩余波前像差畸变。由于 上述Shack-Hartmann(S-H)波前传感算法为线性处理速度,满足检测装置的实时性要求, 适用于各等晕区在出瞳面和后出瞳面上的波前传感。也可由第一波前传感器12a和第二波 前传感器12b采集光强信号后再发送给所述控制装置,由所述控制装置根据不同的波前传 感算法(例如相位恢复(PR)波前传感算法,Shack-Hartmann (S-H)波前传感算法)获得当 前传感平面上的波前像差畸变,若波前传感器放在出瞳面,则检测出瞳面波前畸变;若放在 后出瞳面则检测出后出瞳面上波前像差畸变。
[0045] 作为检测装置1的一种优选实施方式,检测装置1还包括第一位置调整单元13a 和第二位置调整单元13b,其中:第一位置调整单元13a和第二位置调整单元13b依次设于 荧光激发单元11和成像装置3之间,具体地:第一位置调整单元13a和第二位置调整单元 13b依次设于中继透镜41和荧光激发单元11之间的两个出瞳面共辄面上,并且用于调整激 发光照射在组织平面Al上的光斑位置。由于光斑在组织平面Al上位置包括水平位移和竖 向位移,因此可以选择第一位置调整单元13a调整光斑在Al的水平方向的位置,第二位置 调整单元13b调整光斑在组织平面Al的竖直方向的位置。第一位置调整单元13a和第二 位置调整单元13b分别可以采用电流计驱动的单轴振镜,通过输入电流值改变单轴振镜的 转动角度,可以调整光斑在组织平面Al的位置。
[0046] 本实施方式所提供的荧光光片显微成像系统的成像装置3包括载物台、片光照明 单元31、显微物镜32、会聚透镜33和图像探测器34,其中:所述载物台用于支承活体样本 A,且界定了活体样本A的轴线以使大致安置在所述轴线上的样品成像。所述载物台采用的 是电动载物台,该载物台具有三轴电动平移功能,一个升降轴和两个平移轴,它们均需要闭 环控制,且具有小步长下(〈5微米)的高速响应,其中升降轴用来精确定位片光照明单元31 当前照明的深度位置,即组织平面Al的深度位置。由于所述载物台装调误差的存在,当所 述载物台升降时会造成活体样本A相对于显微物镜32的光轴具有微小的横向偏移,使用高 倍数显微物镜时该横向偏移量在图像上将不可忽略,需要通过初始化标定装置10初始化 标定后,驱动载物台的两个平移轴在不同深度上予以实时的横向位置补偿。
[0047] 优选地,初始化标定装置10包括LED光源10a、会聚透镜IOb和中性分光立方10c, LED光源IOa可通过TTL信号精确控制光源的开关时序。在初始化标定中,该LED光源发 出的发散光经由会聚镜IOb和中性分光立方IOc (镀膜为反射/透射比8:92)反射后汇聚 在显微物镜32的后出光端面(第一出瞳面4a)上,再经过显微物镜32反向传播到工作平 面上形成准直照明光,此时将刻有多组已知交叉线条结构的反射镜平片放置在该工作平面 上,随即可开展载物台三个运动轴相对图像探测器34坐标的各项几何标定。
[0048] 片光照明单元31可操作以在与活体样本A相交的组织平面Al内产生激发片层 光,优选地,片光照明单元31的数量至少为两个,并且对称地布置在组织平面Al的左侧和 右侧,并用于使激发片层光能够较为均匀地将组织平面Al照明,利于获得清晰的组织平面 Al的图像。片光照明单元31具体包括激发光源31a和光片显微物镜31b,激发光源31a发 出的激发光通过光片显微物镜31b形成激发片层光,用以照射活体样本A,由此活体样本A 的组织平面Al被选定。显微物镜32的光轴与活体样本A的轴线位于同一条直线上,并用 于对波前校正后的组织平面Al进行放大。会聚透镜33和图像探测器34用于对经放大的 组织平面Al成像。
[0049] 本发明藉由多个远心成像光路,即4f系统,搭建荧光光片显微成像系统。其原因 在于:如图4所示,图4中示出的远心成像光路包括两个相同焦距的透镜L1,两透镜Ll位 于同一光轴上,且距离是透镜Ll焦距的2倍,那么在两透镜Ll的两侧分别具有一个出曈 面Hl、H2,两透镜Ll之间的中点处具有一个像面H3,出曈面H2的后方还具有一个后出曈面 H4。出曈面H1、H2均为平行光,且组织平面Al成像视场各等晕区波前像差畸变将呈现在出 曈面H1、H2的同一区域,因此可以在出曈面H2放置第一波前传感器12a和第一校正器21。 后出瞳面H4上各个等晕区波前像差畸变分布可分离,这样组织平面Al成像视场各等晕区 波前像差畸变将分别呈现在后出曈面H4的不同区域,因此可以在后出曈面H4放置第二波 前传感器12b和第二校正器22。
[0050] 如图5所示,根据上述光学原理,本实施方式中的荧光光片显微成像系统还包括 第一远心成像光路4和第二远心成像光路5,其中:第一远心成像光路4具有第一出曈面4a 和第二出曈面4b,第二远心成像光路5具有第三出曈面5a和第四出曈面5b,第一出曈面4a 与显微物镜32的后出光端面重合,第三出曈面5a与第二出曈面4b垂直相交且交点处设 第一位置调整单元13a,第四出曈面5b设第二位置调整单元13b。第一位置调整单元13a 和第二位置调整单元13b在光路中处于共辄位置,分别用来调整出瞳面上光束的两倾斜分 量,由此实现激发光在组织平面Al上的二维点扫描,以及扫描点产生的受激发射光按原路 返回至第二位置调整单元13b后均成为轴上点激发光束。
[0051] 上述实施方式中,所述荧光光片显微成像系统还包括第三远心成像光路6和第四 远心成像光路7,其中:第三远心成像光路6具有第五出曈面6a
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