8] 图13两种纯化方法对比。M:蛋白Marker ;1:总菌液；2 :流传液；3 :破菌后上清 4 :KC1纯化；5 :亲和层析纯化；
[0049] 图14重组N蛋白免疫印迹分。M :蛋白Marker ;1 :N蛋白。
【具体实施方式】
[0050] 一、实验材料：
[0051] I. 1菌株和质粒
[0052] 大肠杆菌DH5a和BL21(DE3) ;pET_28a(+)原核表达载体均由本实验室保存。
[0053] TGEV和PEDV二联苗、RV、PRSSV、APP、HPS阳性血清均是由本实验室保存。
[0054] 1. 2 试剂
[0055] 反转录试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青酶素、卡那青霉素、总RNA提取试 剂盒（离心柱型）、50mg/ml IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷）、DAB、TMB、2xTaqPCR Mastermix、DNA Marker III、DL2000、预染Marker III购自北京天根生化科技有限公司。小 量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；PrimeScript RT reagent Kit、BamHI、 XhoI均购自大连宝生物工程有限公司。PGEM-T载体、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PEDV抗体 检测试剂盒购自成都飞克生物技术公司。
[0056] 1. 3 设备
[0057] Sorvall ST 16R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；MyCyclerTMPCR仪、琼脂糖水 平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、凝胶成像系统、核酸蛋白仪，美国BIO-RAD公司。
[0058] 实施例1本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的制备
[0059] 一、实验方法
[0060] I. I N基因的克隆与生物信息分析
[0061] 1.1.1引物设计
[0062] 参照GenBank上已发表的PEDV N基因序列，设计了 一对特异性引物进行PCR扩增， 上游引物：5' -GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAG-3' 下游引物：5' -CTCGAGTTAATTTCCTGTATCG AAGATC-3'上、下游引物的5'端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，下划线为酶切位点， 引物由上海英骏公司合成。
[0063] I. L 2 病毒 RNA 提取
[0064] 根据总RNA提取试剂盒的方法步骤提取总RNA。具体如下：
[0065] (1)提取250 μ L病毒悬液置于I. 5mL灭菌的离心管中，加入200 μ L氯仿于离心管 中，剧烈振荡15s，室温静置3min。4°C，12000r/min离心10min，小心把三层中的水相层吸 取到另一个新的I. 5mL离心管中。
[0066] (2)缓慢加入0. 5倍体积的无水乙醇，混匀。将溶液和沉淀一起加入到吸附柱CR3 中。4°C，12000r/min离心30s，弃掉收集管中的废液。
[0067] (3)加500 yL去蛋白液RD(事先已加入相应体积的乙醇）于吸附柱中，4°C， 12000r/min离心30s，尽量弃掉收集管中的废液。
[0068] (4)加700 μ L漂洗液RW(已加入相应体积的乙醇）于吸附柱CR3中，室温静置 2min，4°C，12000r/min离心30s，扔掉收集管中的废液。
[0069] (5)重复步骤（4)。将吸附柱放入I. 5mL收集管中，4°C，12000r/min空离2min，倒 掉残余液体。
[0070] (6)在超净工作台内通风5min，使乙醇充分挥发。
[0071] (7)将吸附柱转入一个新的I. 5mL的离心管中，在吸附柱CR3中央加入30 yL RNase-free ddH20,室温静置 2min，4°C，12000r/min 离心 2min，弃掉吸附柱，置-20°C保存 备用。
[0072] I. I. 3 N 基因的 RT-PCR
[0073] 将提取的总RNA进行RT-PCR扩增，体系如下：
[0074] cDNA反应体系：
[0075]
【主权项】
1. 一种检测抗猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：它是以氨基 酸序列如SEQIDNO:2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白为抗原，检测待检样品中的抗 猪流行性腹泻病毒抗体。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA检测试剂盒为间接 ELISA检测试剂盒，它包括如下组分： (1) 氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白； (2) 酶标板； (3) 抗原包被液； (4) 洗涤液； (5) 封闭液； (6) 样品稀释液； (7) 酶标二抗； (8) 底物液； (9) 终止液。
3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述抗原包被液是碳酸盐溶液。
4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液或样品稀释液是PBST 溶液。
5. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述封闭液为5 %的脱脂牛奶、1 % 的BSA或3%的明胶。
6. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶 标记兔抗猪IgG。
7. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物液是浓度为0. 208mmol/ L的TMB溶液。
8. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述终止液是浓度为2mol/L的 H2SO4溶液。
9. 权利要求1~8任意一项检测试剂盒的使用方法，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 包被：取氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，用包被 液稀释至蛋白浓度为〇. 313~10yg/mL，包被酶标板，洗涤； (2) 封闭：加入封闭液封闭，洗涤； (3) 加待检样品：取待检样品，用稀释液稀释10~320倍，加入微孔板中，37°C温育lh， 洗绦； (4) 加酶标二抗：取酶标二抗，用稀释液稀释2000倍，加入微孔板中，37°C反应30min， 洗绦； (5) 加底物：加入底物液，室温避光反应10~15min; (6) 终止反应：加入终止液，终止反应，测定其0D450值。
10. 根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于： 步骤（1)中，用包被液稀释蛋白至浓度为2. 5yg/mL; 步骤（3)中，待检样品用稀释液稀释20倍。
11. 权利要求1~8任意一项检测试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒中的 用途。
【专利摘要】本发明公开了一种检测抗猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA检测试剂盒，它是以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白为抗原，检测待检样品中是否含有抗猪流行性腹泻病毒的抗体。本发明还公开前述试剂盒的使用方法和用途。本发明由重组猪流行性腹泻病毒N蛋白组成的试剂盒，可以有效检测抗猪流行性腹泻病毒抗体检测的特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点，可用于临床检测猪是否携带猪流行性腹泻病毒，应用前景良好。
【IPC分类】G01N33-561, G01N33-569
【公开号】CN104730238
【申请号】CN201510059767
【发明人】黄小波, 曹三杰, 张雨迪, 文心田, 段素芬, 文翼平, 伍锐, 朱书权, 邓丽, 李亚青, 梁恩涛
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月5日