超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球在免疫层析上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到生物医学诊断领域，，特别是涉及到一种超支化聚缩水甘油醚修饰 纳米微球在免疫层析上的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫层析技术是利用液体的毛细作用，让待测物通过层析在检测线处发生特异性 的免疫反应，通过肉眼或者相应仪器检测，获得判断结果。它结合了亲和技术、标记技术、印 记技术和层析技术等技术方法，是制备体外诊断试剂的一种重要方法，具有价格低，检测快 速等特点。免疫层析的另一大优势是几乎不需要繁复的设备，有着便利的用户操作性，符合 床边检测（POCT)的策略。它已经成为高度细化检测诊断平台的有力竞争者，伴随着简便的 读数和样本处理，加上集成的打印设备和随声携带功能，不仅在实验室研宄上，更在家庭和 小型门诊使用等方面开拓了广大的市场。
[0003] 目前所用的免疫层析试剂方法学可分为胶体金法和荧光法。以胶体金为代表的层 析技术已经发展了 20多年，目前仍然广泛使用，但由于只能用于定性或者半定量的检测， 定性检测的结果只有阳性和阴性，而人体内的一些物质的含量常在一定范围内变动，仪器 得出的阳性或阴性判定常常不能让人满足，难以满足临床检测指标具体的要求，同时检测 结果呈弱阳性时，极易造成人为漏检现象，因此存在灵敏度较低等问题。荧光技术逐渐在 免疫层析中占主导地位，然而该技术仍然存在灵敏度欠佳，标记步骤复杂，抗体成本高等缺 点。免疫层析快速检测技术的主要发展方向有：提高灵敏度并拓宽免疫层析分析的检测范 围，采用信号聚集放大系统并简化检测仪器。
[0004] 微球作为免疫层析分析中的重要组成，其本身的性质十分重要。目前常用的商品 化微球是聚苯乙烯微球，功能性基团通过共聚、枝接、包裹等方式结合在微球上。这种为求 有两个确定。其一，聚苯乙烯微球为疏水材料，直接应用会产生非特异性吸附，影响检测的 可信度，易造成误诊和漏诊；其二，无论是如何偶联的基团，都不能突破单层表面最大理论 密度，结合基团越多，对结果的影响就越大
[0005] 聚乙二醇（PEG)是在生物医药方向中使用非常广泛的一个亲水性物质，其生物相 容性以及非免疫源性的特征使得它在很多领域作为改性材料使用，例如抗体、蛋白、核苷 酸、脂质体的修饰，聚合物和聚合物微球的表面改性等。在免疫分析中，纳米粒子表面的PEG 可以有效的降低非特异性吸附，减少本底值，提高反应的灵敏度，降低假阳性和假阴性结 果。但是线性的PEG聚合物由于其结构中只在聚合物端基部分有官能团，整个聚合物结构 中只有一个或者两个活性位点可供于偶联，结合能力较弱，偶联效率不高，这点限制了其更 广泛的应用。
[0006] 与线性聚合物不同，超支化聚合物（支化程度至少大于等于2)在结构分支处包含 较多的官能团。超支化聚合一般有较好的溶解性，溶解后粘度较低和流动性也较好，使用上 简单方便。再者，超支化聚合物合成方法也比较简单，主要分成三种：第一，利用多官能团的 单体缩聚制备；第二，在已经制备好的聚合物前驱体中进行接枝修饰，第三，利用环氧的开 环反应来制备超支化的结构。
[0007] 超支化聚缩水甘油醚是一种特殊的超支化聚合物，有着类似聚乙二醇的主链结 构，在支链结构上富含羟基，这部分羟基一方面提供了大量结合位点，另一方面又给聚合物 带来了良好的亲水性能。这些结构特点使超支化聚缩水甘油醚具有大量的末端官能团，拥 有良好的生物相容性、高溶解性和高流变性。所以利用超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球 应用于免疫层析上，由于其大量的末端官能团效应，可以大大加强免疫分析中抗原抗体结 合效率，能够极大的增强分析的灵敏度。
【发明内容】
[0008] 本发明针对干式免疫层析分析法现有技术的上述不足，公开了一种超支化聚缩水 甘油醚修饰纳米微球在免疫层析上的应用方法。
[0009] 本发明还公开了一种超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球干式免疫层析试纸条。
[0010] 为实现上述目标，本发明采用以下的技术方案予以实现：
[0011] 超支化聚缩水甘油醚修饰微球纳米在免疫层析上的应用，包括以下方法：
[0012] (I)超支化聚缩水甘油醚经修饰后包被在纳米微球表面形成超支化聚缩水甘油 醚修饰纳米微球，对超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球活化后连接能与待测分子特异性结 合的探测分子形成超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球~探测分子复合物，再标记上荧光物 质，清洗分离未标记的荧光物质和探测分子，将能够与待测分子特异性结合的捕获分子包 被在硝酸纤维素膜检测线上，将荧光超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球复合物均匀分布于 结合垫上，滴加样本后待测分子随液体层析，在结合垫上荧光超支化聚缩水甘油醚修饰纳 米微球复合物和待测分子结合形成超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球~探测分子~待测 分子复合物，最后复合物被捕获分子结合，在检测线上形成荧光超支化聚缩水甘油醚修饰 纳米微球~探测分子~待测分子~捕获分子复合物，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度 进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
[0013] 或者是，
[0014] (II)超支化聚缩水甘油醚经修饰后包被在纳米微球表面形成超支化聚缩水甘油 醚修饰纳米微球，对超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球活化后连接能与待测分子特异性结 合的探测分子形成超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球~探测分子复合物，再标记上荧光物 质，清洗分离未标记的荧光物质和探测分子，将能够和待测分子竞争性结合纳米微球~探 测分子的竞争分子包被在硝酸纤维素膜检测线上，纳米微球~探测分子均匀涂布在结合垫 上，滴加样本后待测分子随液体层析，硝酸纤维素膜上的竞争分子和待测分子将竞争结合 纳米微球~探测分子，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分 析物的浓度，待测分子浓度越高，荧光强度越弱，反之则荧光强度则越强。
[0015] 所述超支化聚缩水甘油醚由三羟甲基丙烷和缩水甘油聚合而成，所述超支化聚缩 水甘油醚的修饰是用硬脂酸盐修饰超支化聚缩水甘油醚。
[0016] 所述的活化是对超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球端基的活化，所述端基优先为 氨基、羧基等基团。
[0017] 所述的待测分子为抗原、抗体、半抗原、半抗体等物质；所述的探测分子为能特异 性结合待测分子的物质；捕获分子是能特异性结合待测分子的另一种物质；竞争分子是和 待测分子结构或功能相似且竞争性结合探测分子的物质。
[0018] 所述的荧光物质选自异硫氰酸荧光素，3H~吲哚菁类染料、荧光素 cy5、荧光素 cy7、羧基荧光素、2~甲氧基荧光增强素、罗丹明、量子点、EGFP绿色荧光增强蛋白、藻红蛋 白、稀土铕、上转发光物质等物质中的一种或几种或含有上述荧光物质的复合物质。
[0019] 所述超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球大小为20nm~500nm。
[0020] 所述超支化聚缩水甘油醚修饰纳米微球制备方法如下：
[0021] 1)超支化聚缩水甘油醚的制备：以三羟甲基丙烷（TMP)作为反应的引发剂，采用 甲醇钾（CH30K)对TMP的羟基去质子化，然后将缩水甘油缓慢滴加进入体系引发聚合，反应 结束后产物溶解在甲醇中，聚合物通过在丙酮中析出，甲醇中溶解，重复两次进行提纯，得 超支化聚缩水甘油醚；
[0022] 2)超支化聚缩水甘油醚的修饰：将超支化聚缩水甘油醚用琥珀酰亚胺基碳酸酯 (DSC)进行修饰得DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚（HPG);
[0023] 3)超支化聚缩水甘油醚对纳米微球的修饰：向纳米微球溶液中滴加上一步制备 的DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚溶液，反应结束后向反应体系中加 PBS溶液继续反应，水 解多余的NHS酯后，用PBS溶液清洗微球，清洗结束后，溶液重悬得超支化聚缩水甘油醚修 饰纳米微球；
[0024] 4)探测分子~荧光物质的制备：探测分子溶解于PBS缓冲液中，荧光物质溶解于 二甲基亚砜（DMF)中，然后将探测分子与荧光物质以I : 1~1 : 3混合，充分搅拌，然后 将溶液置于透