一种杜仲三倍体的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杜仲三倍体的选育方法，尤其涉及高温诱导杜仲大孢子染色体加 倍提高杜仲三倍体得率的方法，属于杜仲三倍体的选育领域。
【背景技术】
[0002] 多倍体是指体细胞中含有三个或者三个以上染色体组的个体。多倍体广泛的存在 于自然界之中，通常来源于体细胞有丝分裂过程中的染色体加倍或减数分裂过程中产生的 未减数配子与正常配子杂交。目前常用的人工诱导染色体加倍方式有化学诱导、物理诱导 和生物技术。
[0003]杜仲属于二倍体(2n = 2x = 34)，是极具潜力的温带胶源树种。在环稀醚砲苷类等 药效成分利用方面也具有重要价值。从目前杜仲的遗传改良现状看，尽管杜仲雌雄异株、异 花授粉，但群体内个体间的差异性是有限的，很难通过直接选择优株来获得杜仲胶等次生 代谢产物的大幅度提高；由于杜仲为单科、单属、单种存在(周政贤.中国杜仲[M].贵州:科 技出版社，1993)，也无法利用种间杂交获得的杂种优势等。而植物多倍体由于染色体数目 倍增，常带来一些形态和生理上的巨大性变化，如细胞体积增大、叶片增大变厚、代谢物含 量增多等。从代谢产物变化看，三倍体漆树的产漆量比二倍体高出1-2倍（尚宋燕，张继祖 等.漆树染色体观察及三倍体漆树的发现[J].西北植物学报，1985，5(3): 187~191);四倍 体橡胶的产胶量比二倍体亲本提高30%以上等(林道拔.橡胶树多倍体试验初报[J].热带 作物科技，1991 (3): 56-58)。显然，要想较大幅度地提高杜仲叶片的含胶量，综合倍性优势 和杂交优势的多倍体育种途径最为可行。
[0004] 最早朱登云等通过胚乳培养突破性地获得了大量三倍性胚乳愈伤组织及其再生 植株(朱登云，蒋金火.由杜仲成熟干种子胚乳培养再生完整植株[J].科学通报，1998,4: 307-312)，但对这些胚乳再生植株的镜检结果证明，其染色体数目均恢复为二倍体，未能取 得预期效果。王跃华采用不同浓度的秋水仙碱溶液对杜仲种子进行不同时间的诱导，发现 经诱导后的材料具有明显的多倍体特征，用0.4%的秋水仙碱溶液处理48h和用浓度为 0.8%的秋水仙碱溶液处理24h的诱导率都较高(王跃华.杜仲种子的多倍体诱导研究[J]. 亚太传统医药，2006,8:73-76)。张海凤使用不同浓度的秋水仙碱处理刚刚萌发的种子，获 得了四倍体，其中〇. 1%处理生长点12h的变异率最高(张海凤，郭宝林.杜仲四倍体的诱导 与鉴定[J].园艺学报，2008,7:1047-1052)。但是上述的这些传统的活体诱导处理方法或诱 变率低，或嵌合率高，且获得的均为同源四倍体，难以实现倍性优势和杂种优势的综合利 用。
[0005] 杜仲目前尚未发现天然三倍体，所以必须采用人工诱导的方式。近些年，通过利用 2n配子去诱导产生三倍体被证明是一条非常有效的途径。高鹏等报道在杜仲小孢子减数分 裂前期时采用〇 . 1 %_〇. 2%的秋水仙碱处理24h-36h最高可获得49.5%的2n花粉(高鹏，林 威，康向阳.秋水仙碱诱导杜仲花粉染色体加倍的研究[J].北京林业大学学报，2004，26 (4): 39-42)。毛彦科等采用"树木非离体枝芽加热处理装置(授权公告号：101057555B)"处 理发育到一定程度的雄花芽，可获得超过40%的2η花粉诱导率，但将2η花粉授粉杂交后并 没有获得杜仲三倍体，这可能是由于2η花粉与正常倍性花粉相比，竞争力较差所致（毛彦 科，张平冬，石乐，董春波，索玉静，康向阳.高温诱导杜仲2η花粉最佳处理条件研究[J].北 京林业大学学报，2013,35(1)，53-58)。
[0006] 与利用2η花粉相比，由于利用2η雌配子不存在与单倍性配子竞争问题，受精后2η 雌配子可全部形成三倍体，因此采用2η雌配子选育三倍体更具诱惑力。高鹏利用秋水仙碱、 安磺灵等化学试剂采用不同的处理组合连续对杜仲雌花芽进行多年处理，花芽均逐渐枯萎 脱落，获得的苗木经染色体检测后没有发现三倍体变异植株(高鹏.杜仲配子与合子染色体 加倍技术研究[D].北京:北京林业大学图书馆，2006)。这说明了化学处理诱导大孢子染色 体加倍对雌花芽伤害较大，这种方式可能并不适用于杜仲。而通过极端的温度变化来诱导 染色体加倍一般是将一、二年生草本植物、可盆栽的小灌木以及可通过切枝水培至种子成 熟的乔木花枝放入恒温箱中施加高温处理，获得2η雌配子再与正常异性配子杂交获得多倍 体。但杜仲属于乔木，树可高达20m，并且种子成熟期长，从受精到种子成熟需要经历7个月， 所以杜仲无法像杨树一样先切枝水培后再放入恒温培养箱中进行高温处理。毛彦科对非离 体的杜仲雌花芽施加高温，最终从散粉后第1天48°C高温持续处理4h得到了 1株杜仲三倍体 (毛彦科.高温诱导杜仲配子染色体加倍技术研究[D].北京:北京林业大学图书馆，2012)。 但是由于该研究的杜仲三倍体得率太低，导致在生产实践中无法进行推广。因此有必要进 一步进行研究，找到在高温诱导杜仲大孢子染色体加倍过程中最佳诱导参数，显著提升杜 仲三倍体的诱导得率，这对于杜仲大孢子染色体加倍选育三倍体以及将该方法引入其他无 法进行离体诱导三倍体的植物具有重要的借鉴意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种杜仲三倍体的选育方法，该方法显著提高杜仲三倍体诱 导效率，明显增加了杜仲三倍体诱导的可靠度，为杜仲三倍体的选育创造有利的条件。
[0008] 为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 一种杜仲三倍体的选育方法，包括:对杜仲雌花花芽施加高温处理后依次进行授 粉、收集种子、播种育苗、倍性检测;所述的高温处理是当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后 对杜仲雌花花芽施加42 °C-48 °C的温度处理。
[0010]其中，优选的，对杜仲雌花花芽施加42°C-45°C的温度处理;更优选的，对杜仲雌花 花芽施加45 °C的温度处理。
[0011]优选的，当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后的第1天至第5天中的任何一天对杜仲 雌花花芽施加高温处理;更优选的，当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后的第1天至第4天中 的任何一天对杜仲雌花花芽施加高温处理;最优选的，当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后 的第2天或第3天对杜仲雌花花芽施加高温处理。其中，在对杜仲雌花花芽施加高温处理时， 可以采用授权公告号：1〇1〇57555Β的（实用新型名称:树木非离体枝芽加热处理装置)进行 高温处理。
[0012] 所述的高温处理时间为0.5-8h;优选为2-6h;更优选为2-4h;最优选为4h。
[0013] 本发明对高温诱导杜仲大孢子染色体加倍过程中最佳诱导参数进行了筛选。在杜 仲雌株周边的雄株散粉后的第1-5天分别施加42°C、45°C、48°C高温持续处理杜仲雌株花芽 2h、4h、6h，统计各处理组合的种子数、成苗数、三倍体株数和三倍体得率。结果表明：共选育 出杜仲三倍体22株。其中，处理温度对于杜仲三倍体的选育是一个非常关键的因素。当处理 温度为45 °C时，共选育出20株杜仲三倍体，明显高于42 °C和48 °C的处理温度，表明对杜仲雌 花花芽施加45°C的高温，能明显提高杜仲三倍体的得率。杜仲雌株周边的雄株散粉后的天 数和持续处理时间对杜仲三倍体选育也具有显著性的影响。在杜仲雌株周边的雄株开始散 粉的第5天没有得到杜仲三倍体，在第1-4天均不同程度的得到了杜仲三倍体，但是存在显 著差异。周边的杜仲雄株散粉后第1-4天，分别获得杜仲三倍体的株数为2、7、11、2株，表明 当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后第2天和第3天，杜仲三倍体得率较高，明显高于第1天和 第4天，所以当杜仲雌株周边的雄株开始散粉后第2天和第3天(第三天效果最好），可明显提 高杜仲三倍体的得率。另外，对于高温处理的持续时间通过比较可以看出：当持续处理时间 为4h时，共获得18株杜仲三倍体，显著高于其他处理时间。通过以上分析，在杜仲雌株周边 的雄株散粉后第2天和第3天，对雌株花芽施加45°C的高温持续处理4h时，分别获得杜仲三 倍体7和10株，得率分别为3.26%和3.82%，明显高于其他组合，也明显高于现有技术，即对 杜仲雌花芽施加高温，从散粉后第1天48 °C高温持续处理4h得到的1株杜仲三倍体(毛彦科. 高温诱导杜仲配子染色体加倍技术研究[D].北京:北京林业大学图书馆，2012)。
[0014]本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0015]本发明对能显著影响杜仲三倍体得率的高温诱导杜仲大孢子染色体加倍选育三 倍体的处理时期、处理温度和持续处理时间等参数进行了筛选和优化，优化后的参数明显 提高了杜仲三倍体诱导效率，显著增加了杜仲三倍体诱导的可靠度，大大降低了工作量，有 效的节约了成本，具有更强的可操作性。