专利名称：产丁二酸基因工程菌及其构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及产丁ニ酸基因工程菌及其构建及应用，具体涉及ー种高效利用葡萄糖生长并产丁ニ酸基因工程菌^SdericAia coli BA016的构建及其生产丁ニ酸的方法。
背景技术：
丁ニ酸，俗称琥珀酸，作为ー种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物中，许多厌氧微生物生产丁ニ酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为ー种优秀的C4平台化合物，丁ニ酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物的前提，美国能源部的报告将丁ニ酸列为未来12种最有潜力的生物基大宗化学品中的第一位.。许多厌氧微生物能够生产丁ニ酸作为其能量代谢的主要末端产物。传统丁ニ 酸化学合成法采用以不可再生的战略资源石油作为原料，环境污染严重，无法实现可持续发展。利用生物转化法转化可再生资源来生产丁ニ酸，成本低，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收大量的CO2，有效减轻温室效应，近年来受到了各国科研人员的关注。在众多的琥珀酸生产菌中，大肠杆菌具有培养条件简单、代谢网络明确、易改造、易操作等特点，已成为生物法合成丁ニ酸的研究热点。现有的产丁ニ酸大肠杆菌基因改造策略主要有增强代谢途径中的关键酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCK)、失活或敲除竞争途径中的酶(如乳酸脱氢酶LDH、丙酮酸甲酸裂解酶PFL)、引入新的代谢途径(如こ醛酸循环)等。其中，E. coli NZNlll由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，丙酮酸的代谢支路大大減少，丙酮酸大量积累，最終导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株疋coliAFPl 11由于突变了葡萄糖专性转运系统中的/7 tsG基因，菌株使用葡萄糖激酶系统进行葡萄糖的转运，使丙酮酸的积累不再是糖转运的限制因素，恢复了菌株在厌氧条件下利用葡萄糖的能力，且产物主要为丁ニ酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFPlll过程中，丁ニ酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g じ1因此，在高产丁ニ酸大肠杆菌菌株构建过程中，減少丙酮酸的积累是重组大肠杆菌高产丁ニ酸的关键因素之一。大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径如图I所示，涉及其合成的基因主要有三个也，/ a^)，涉及分解代谢的基因主要有两个lyjaD,yrfE、,而NAD+和NADH相互之间的转化反应则多达300多个。相关研究表明，利用DNA重组技术改造NAD (H)生物合成途径是提高NAD(H)总量的有效手段。E. coli NZNlll由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD 的不平衡(NADH/NAD+比例超过2)，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。因此，在高产丁ニ酸大肠杆菌菌株构建过程中，确保胞内辅酶NAD(H)的平衡是重组大肠杆菌高产丁ニ酸的关键因素之一。San等人(Metab Eng, 2002, 4: 238-247 ；Metab Eng, 2002, 4: 182-192)在研究辅因子调控对大肠杆菌代谢流分布的影响过程中，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶使胞内NAD(H)总量提高了 41. 7% ;Heuser等人(Eng Life Sci, 2007, 7: 343-353)通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同时表达这两个酶，使菌株胞内NAD(H)总量提高了 2倍多，并将其应用到酶转化合成(R)-甲基-3_羟基丁胺过程中，使得NAD (H)的量不再成为限制因素，从而提高了酶转化的效率。由于缺失了丙酮酸甲酸裂解酶基因/7/7ガ和乳酸脱氢酶基因ん导致丙酮酸的大量积累，反馈抑制PTS糖转运系统对葡萄糖的转运，使得菌体在厌氧条件下不能利用葡萄糖，并且生长受到抑制。通过外源引入了汉中的丙酮酸羧化酶基因，使积累的丙酮酸流向草酰こ酸，解除丙酮酸的反馈抑制现象，进而生成丁ニ酸。丙酮酸羧化酶PYC可以催化丙酮酸固定CO2生成草酰こ酸，过量表达该酶可以增加TCA还原臂碳流通量，从而有望提高丁ニ酸的产量。Vemuri等人将疋e中的/ ァc基因引入NZNlll中，结果丙酮酸减少了 3倍，丁ニ酸产量增加了 52%。岳方方等人在JM1307中过量表达枯草芽孢杆菌中的/^c基因，结果丁ニ酸的产量增加了 I. 9倍，同时丙酮酸的量也有所減少。因此本发明通过在万.coli NZNlll中表达/7ァc廣/weガ基因，通过两阶段发酵，得到了高效利用葡萄糖产丁ニ酸的优良菌株^ coli BAO160·
发明内容
本发明针对现有技术的不足，其技术目的在于提供一株能高效利用葡萄糖生长并产丁ニ酸的基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株发酵生产丁ニ酸。为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案
一、本发明提供了一株产丁ニ酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA016(.Escherichia coli BA016)，其保藏号登记号为 CCTCC M 2012350。ニ、本发明同时提供上述的大肠埃希氏菌BA016的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因基因活性的菌株大肠杆菌NZNlll为出发菌株，通过过量共表达外源丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，得到能够高效利用葡萄糖产丁ニ酸大肠埃希氏菌BAO16。进ー步地,所述的具体构建步骤如下
(1)以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的万.coliNZNlll菌株为出发菌株，得到同时缺乏ldM、pflB的感受态菌株；
(2)纯化扩增出丙酮酸羧化酶基因(/7JC)，构建得到表达丙酮酸羧化酶的表达质粒pi'rc99a- pyc ；
(3)纯化扩增出烟酸磷酸核糖转移酶基因(/7/7M)，连接到步骤(2)所述的重组质粒pTrc99a- 上，构建得到过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒pTrc99a- pyc- pncB ；
(4)将步骤(3)中得到的质粒导入步骤(I)中得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(5)利用步骤(4)得到的阳性转化子过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时，減少丙酮酸的积累，得到可利用葡萄糖代谢产丁ニ酸基因工程菌大肠埃希氏菌BA016。三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌BA016发酵生产丁ニ酸的方法其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。进ー步地，具体步骤如下将大肠埃希氏菌BA016按体积比1%的接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD6tltl至0. 4 0. 6时用0. 5 mM的IPTG诱导至0D6(I(I=3吋，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。同时，上述的有氧阶段发酵培养基是现有技术中有氧培养产丁ニ酸大肠杆菌的常规培养基；厌氧阶段发酵培养基是以葡萄糖为碳源的产丁ニ酸大肠杆菌用发酵培养基。有益效果本发明提供的菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于エ业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。
图I大肠杆菌中含有PYC途径的厌氧混合酸发酵途径；
其中，矩形方块处表示敲除失活的酶，虚线部分表示新构建的途径。图2大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径。图3重组质粒pTrc99a-/ ァc的构建图谱。图4重组质粒pTrc99a_/ ァ的构建图谱。图5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。图6 PCR产物pncB的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。图7重组质粒pTrc99a_/7ァc的双酶切鉴定图。 图8重组质粒pTrc99a_/7ァC-/7/7Cガ的双酶切鉴定图。本发明的微生物的分类命名为大肠埃希氏菌BA016 (.Escherichia coli BAO16),其保藏日期为2012年09月14日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO M 2012350。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来进ー步说明本发明，仅是作为典型情况的说明，并非是对本发明的限定。本发明的生物材料的来源的说明
1、质粒来源
(I) pTrc99a :购自 Introvegen 公司；
2、基因组模板来源GENEBANK。3、出发菌株'E. coli NZNlll的感受态菌株的来源有两处
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547.X，申请日1996. 10. 31，授权曰2003年I月I日，授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。4、引物的设计及合成自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例I构建表达外源丙酮酸羧化酶的质粒pTrc99a-/ ァc的过程包括
I、合成带有Nco I和/ (I酶切位点的引物上游引物5’ - CATGCCATGGTCAGCTGATGAGAAACGTCGAGAAG -3’ ；
下游引物5’ _ AAAACTGCAGGGTCATCTCTTCAAAGCCAAAACGA-3’。2、认Lactococcus lactis cremoris NZ9000基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 300s, 35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的/7ァc基因后,表达质粒pTrc99a用AfcoI双酶切、连接获得重组质粒pi'rc99a-/7j^0实施例2 构建过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到菌株coli BAO16 I、构建过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒，其过程包 括 (I)合成上下游引物都带有AfcoI酶切位点的引物，
上游引物5’ -CATGCCATGGGAAAGGTGGCATATGGTGTGATCGG-3，；
下游引物5’ -CATGCCATGGCGGCTACAGGCACAACGCTCATAAT -3’。(2)以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5min ； (94°C 45 s，63°C 45 s，72°C 96s, 35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的/7/ cガ基因后，质粒pTrc99a-/ cA用//III单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a_/ ァ2、将质粒pTrc99a-/ ァ导入同时缺乏ldhA、pflB的感受态菌株,获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌coli BAO16o实施例3过量共表达新构建的重组大肠菌株^scAericAia coli BA016与出发菌株NZNlll的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。大肠杆菌NZNlll当导入质粒pTrc99a-/ ァC-/7/7Cガ后,过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶恢复了厌氧条件下重组菌的氧化还原平衡，NAD(H)的总量有明显的提高，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁ニ酸，无甲酸和乳酸的积累。采用厌氧血清瓶发酵，将大肠埃希氏菌BA016按体积比1%的接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体0D_至0. 4 0. 6时用0. 5 mM的IPTG诱导至0D6(i(i=3时,按接种量10%(v/v)转接血清瓶厌氧发酵48h。厌氧血清瓶发酵用培养基为LB+葡萄糖(20 g/L) +碱式碳酸镁0. 48 g+Amp (氨苄青霉素 50 u g/mL) +0. 5 mM IPTG+0. 5 mM NA (烟酸)。厌氧血清瓶培养后各种參数的測定结果见表I。表I厌氧血清瓶培养后各种參数的測定结果
权利要求
1.一株产丁ニ酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA016 (.Escherichiacoli BA016)，其保藏登记号为 CCTCC M 2012350。
2.根据权利要求I所述的大肠埃希氏菌BA016的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌NZNlll为出发菌株，过量共表达外源丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶后，得到大肠埃希氏菌BA016。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体构建步骤如下 (1)以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的万.coliNZNlll菌株为出发菌株，得到同时缺乏ldM、pflB的感受态菌株； (2)纯化扩增出丙酮酸羧化酶基因，构建得到表达丙酮酸羧化酶的表达质粒pTrc99a-pyc ； (3)纯化扩增出烟酸磷酸核糖转移酶基因，连接到步骤(2)所述的重组质粒pTrc99a-pyc上，构建得到过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒pTrc99a-pyc~ pncti ； (4)将步骤(3)中得到的质粒导入步骤(I)的感受态菌株，获得阳性转化子； (5)利用步骤(4)得到的阳性转化子过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时，減少丙酮酸的积累，得到大肠埃希氏菌BAO16。
4.利用权利要求I所述的大肠埃希氏菌BA016发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
5.根据权利要求4所述大肠埃希氏菌BA016发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在干将大肠埃希氏菌BA016按体积比1%的接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD_至0. 4 0. 6时用0. 5 mM的IPTG诱导至OD6(l(l=3吋，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。
全文摘要
本发明提供了一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA016(EscherichiacoliBA016)，其保藏号登记号为CCTCC NOM 2012350。本发明还提供了该菌株的构建方法与发酵生产丁二酸的方法，通过过量共表达外源丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，使重组大肠杆菌能够利用葡萄糖代谢生长，减少副产物丙酮酸的生成，从而大幅度提高丁二酸的得率及生产强度。
文档编号C12N15/70GK102864116SQ20121039283
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者姜岷, 陈旭, 梁丽亚, 万青, 苟冬梅, 刘嵘明, 马江锋 申请人:南京工业大学