专利名称：棉花GhTCP2基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及棉花GhTCP2基因启动子及其组织特异性表达模式的应用。
背景技术：
棉花(Gossypium Hirsutum)作为全球最重要的经济作物之一,其纤维是人类纺织业的主要原材料。与此同时，棉花的种子和油料也是人们日常生产生活中不可或缺的优良资源，在畜牧业和柴油生产方面发挥着重要作用。但是，棉花病虫害很多，尤其是虫害，直接影响棉花产量。其中，棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。该虫是中国棉区蕾铃期害虫的优势种，近年为害十分猖獗，搞好棉铃虫的预测预报及综合防治显得十分重要。
TCP2基因隶属于TCP转录因子家族，最早发现的TCP家族成员包括玉米teosintebranched I (TBI )基因、金鱼草的cycloidea (CYC)基因和水稻PCFl，PCF2基因，这三个成员的英文缩写首字母组即位该家族名称的由来。TCP转录因子蛋白成员有独特的二级结构，其中部含有一个约60个氨基酸组成的保守的DNA结构域(TCPdomain),形成一个非典型的喊性螺旋 _ 环-螺旋结构[non-canonicalbasic-Helix-Loop-Helix (bHLH) structure]，可能参于蛋白质的二聚化和与DNA结合的功能。研究进展表明，TCP家族成员主要在植物的花器官、叶腋、顶端分生组织、腋芽等快速生长的部位表达，这一现象表明，TCP家族可能在细胞分裂和生长发育中起着重要的作用。虫害是影响棉花产量的重要因素之一，棉铃虫主要取食棉花的嫩叶和棉蕾。转基因抗虫棉携带的Bt基因能有效抑制棉铃虫侵害。目前市场上销售的转基因抗虫棉的Bt基因是由花椰菜病毒的35S启动子驱动的，该启动子在植物各个组织都有表达，使得不被棉铃虫取食的其他组织或器官过量表达异源Bt基因，可能对棉花的生长发育，抵御生物和非生物胁迫的能力造成影响。本发明涉及的GhTCP2启动子可以取代目前市场上广泛应用的转基因棉花中的花椰菜病毒的35S启动子，让抗虫基因Bt在棉铃虫取食的主要部位表达，降低了抗虫基因对转基因棉花除抗虫能力外的其他能力的影响。
发明内容
本发明的目的是提供棉花GhTCP2基因启动子序列、其组织特异性表达模式及应用。本发明提供棉花GhTCP2基因启动子，其具有I) SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2) SEQ ID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
本发明提供含有棉花GhTCP2基因启动子的载体。在本发明的实施例中，含有棉花GhTCP2基因启动子的载体为pBI121_GhTCP2。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。本发明还提供含有棉花GhTCP2基因启动子的转化植物细胞。本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子在制备转基因植物中的应用。本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子在植物组织中表达模式的应用。其中，所述的植物组织为腋芽或花蕾。其中，所述的表达模式为表达抗虫基因。 其中，所述的植物为拟南芥、水稻或棉花。本发明具有下列优点及有益效果(I)本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子(核苷酸序列如SEQID No. I所示)及其在植物腋芽及花蕾中组织特异性表达模式。(2)通过转化拟南芥野生型Col-Ο，并进行⑶S染色，发现GhTCP2在植物腋芽和花蕾中特异表达(拟南芥、水稻、棉花等)，有望对为在棉花幼嫩的棉铃中表达抗虫基因提供特异的启动子，以提闻棉花的抗虫能力。
图I为GhTCP2基因棉花不同部位半定量PCR结果。图2为含有棉花GhTCP2基因启动子的载体图谱。图3为含有棉花GhTCP2基因启动子的载体酶切验证结果；其中I为空载体pBI121用EcoRV和BamHI双酶切的酶切结果；2为pBI121_GhTCP2载体用EcoRV和BamHI双酶切酶切结果旧代表博迈德生物技术有限公司Ikb DNA ladder。图4为棉花GhTCP2基因启动子驱动⑶S基因转化拟南芥后⑶S染色结果，其中
I.在拟南芥幼苗中表达；2.在幼嫩的根尖部分表达；3.在整个花器官中都有表达；4.在叶腋处表达；5.花器官放大后,发现在幼嫩的花蕾中表达量较强。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。实施例I棉花GhTCP2基因启动子的获得本发明的GhTCP2基因启动子是采用Genome Walking法从市场上购得的陆地棉(Gossypium hirsutum)品种新陆早13号中克隆得到的。将本实验室之前扩增获得的GhTCP2基因中间保守序列(其序列如SEQ ID No. 2所示)、5’ RACE和3，RACE侧翼序列用SeqMan软件进行拼接，根据拼接得到的序列设计引物GhTCP2ProSPl、GhTCP2ProSP2和GhTCP2ProSP3。以棉花基因组总DNA为模板，用Genome Walking Kit同种AP引物进行3次巢式PCR反应扩增基因启动子区。将IstPCR反应液稀释1000倍后，取I μ L作为2nd PCR反应的模板，配制2ndPCR反应液。取2nd反应液稀释1000倍后，取I μ L作为3rdPCR反应的模板，配制3rdPCR反应液。分别用试剂盒中提供的四种AP引物进行三次巢式PCR反应，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。操作步骤如下(I)配制 1st PCR 反应液
权利要求
1.棉花GhTCP2基因启动子，其特征在于，其具有1)SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求I所述基因启动子的载体。
3.如权利要求2所述的载体，其为pBI121-GhTCP2。
4.含有权利要求2或3所述载体的宿主细胞。
5.含有权利要求I所述基因启动子的转化植物细胞。
6.权利要求I所述的基因启动子在制备转基因植物中的应用。
7.权利要求I所述的基因启动子在植物组织中表达模式的应用。
8.如权利要求7所述的应用，所述的植物组织为腋芽或花蕾。
9.如权利要求7所述的应用，所述的表达模式为表达抗虫基因。
10.如权利要求7-9任一所述的应用，所述的植物为拟南芥、水稻或棉花。
全文摘要
本发明涉及棉花GhTCP2基因启动子及其应用。所述的棉花GhTCP2基因启动子序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现GhTCP2基因启动子在植物(拟南芥、棉花等)的腋芽和花蕾中特异表达，可为在棉花腋芽和花蕾中特异性表达抗虫基因提供启动子，减小抗虫基因在其他组织表达对棉花产生的负面影响，在不影响棉花产量的前提下，提高棉花的抗虫能力。
文档编号C12N15/63GK102943075SQ20121039233
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者李学勇, 邢进, 赵金凤, 刘伟娜 申请人:中国农业科学院作物科学研究所