专利名称：甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，具体涉及一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，属生物技术领域。
背景技术：
植物原生质体克服了细胞壁这一屏障，是植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究的理想材料，而且在基因工程及作物改良新品种培育方面有着重要应用前景。近年来，随着植物分子生物学发展，原生质体作为一个单细胞系统广泛地应用在基因定位、基因表达调控、RNA沉默机理、细胞钙信号转导及其调节机制等方面的研究。甘蔗愈伤组织原生质体的研究始于上世纪70年代，原生质体分离、培养和植株再生也获得成功。但是，与模式植物烟草或拟南芥叶肉细胞原生质体研究相比，甘蔗愈伤组织·原生质体分离纯化效果不尽理想，植株再生频率很低，直至今日没有长足发展。以甘蔗愈伤组织原生质体为受体材料，开展甘蔗转基因瞬时表达未见报道。本发明建立高效、快速的甘蔗愈伤组织原生质体的分离和纯化方法，获得高质量、高产量的原生质体可作为外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究的受体材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高效、简便的甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，克服现有甘蔗愈伤组织原生质体分离和纯化方法存在质量和数量上的不足的问题，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供高质量、高产量的甘蔗愈伤组织原生质体。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下
1、甘蔗愈伤组织培养
取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1-2 Cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28°C暗培养1-2个月，每隔2周继代I次；所述MS3固体培养基为MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+3mg/L 2, 4-D+30 g/L 鹿糖 +6. O g/L 琼脂粉；MS 培养基为 1962 年,Murashige 和 Skoog 公开的MS培养基(下同)；
2、甘蔗悬浮细胞培养
将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28 V暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10-15 min,吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28°C暗培养1-2月，每隔I周继代I次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基:MS+0. 5g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，去离子水补足I升；
3、甘蔗原生质体的分离取步骤2的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，100 g离心2 min ;弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100 g离心2 min ;弃上清液，取悬浮细胞2-3克加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液0. 02mol/L MES+0. 4 mo I/L甘露醇+0. 02 mo I/L氯化钾，pH 5. 7 ;所述酶解反应液2 %纤维素酶+0.1 %果胶酶+0.01 mol/L氯化钙+0. I %牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比；
4、甘蔗原生质体的纯化
用无菌水清洗70 ym孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤3获得的原生质体转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min ;弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心I min ;弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体，在电子显微镜下观察，形态正常的原生质体量达IO6个/mL ;所述W5溶液2 mmol/L MES+154 mmol/L氯化纳+125 mmol/L氯化韩+5 mmol/L氯化钾，pH 5. I0本发明还保护利用上述方法分离与纯化的甘蔗愈伤组织原生质体在甘蔗转基因 瞬时表达中的应用。本发明使用的所有化学试剂为分析纯。本发明的优点是，快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。
图I是分离纯化后的甘蔗原生质体，标尺为0. 2 μ m。图2是pUbi-EYFP-Nos和pUbi-P19_Nos (P19是番茄丛矮病毒编码的RNA沉默抑制子)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 _。图3是pUbi-EYFP-Nos和pUbi- Y b-Nos ( Y b是大麦条纹花叶病毒编码的RNA沉默抑制子)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 mm。图4是pUbi-EYFP-Nos和pUbi_Nos (不含任何沉默抑制子的空载体)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 mm。图5是不同启动子质粒转化原生质体后GUS的瞬时表达活性，其中，A为pPr4-GUS-Nos,B 为 pUbi-GUS-Nos，C 为 p35S-GUS_Nos，D 为 pUbi-Nos (空载体)质粒；左侧的标尺表示⑶S活性值,单位为pmol 4-MU/ μ g protein · min,图中误差线为标准误。
具体实施例方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例I :一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括以下步骤
1、甘蔗愈伤组织培养选取生长正常且无病虫害的甘蔗梢部，去除外围的老叶直至最高可见肥厚带叶和顶部长出的多余叶片，保留25 Cm长的心叶组织；用体积比为75 %的酒精溶液进行表面擦洗消毒后，在无菌超净工作台里，将甘蔗心叶组织切成I. 5 cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28 °C暗培养I. 5个月，每隔2周继代I次；
2、甘蔗悬浮细胞培养挑选致密、金黄色、颗粒状的胚性愈伤组织5克，捣碎后，移入100 mL MS3液体培养基，28°C暗培养2周后，将胚性愈伤组织培养液纱布过滤，滤液静置12min，用移液管吸取底部10 mL细小胚性愈伤组织培养液，用100 mL MS3液体培养基在恒温摇床里震荡培养，转速120转/秒，28°C暗培养1-2月，每隔I周继代I次，直至细小、均一的悬浮细胞系出现。3、取步骤2的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，或者将步骤2的悬浮细胞继代培养3天后，分装到50 mL离心管；100 g离心2 min ;弃上清液，加入40 mL酶解缓冲液清洗悬浮细胞，100 g离心2 min ;弃上清液，取悬浮细胞2-3克加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；
4、用无菌水清洗70 μ m孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，将步骤3酶解过夜的甘蔗悬浮细胞通过尼龙网过滤，取5 mL滤液转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min ;弃上清液，I mL冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心I min ;弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体。·
取I mL冰浴的W5溶液再次悬浮原生质体；用血球计数板在100倍显微镜下计算原生质体数量，完整的原生质体如图I所示，低温贮藏备用。实施例2 :利用从甘蔗品种CP72-1210心叶愈伤组织分离、纯化的原生质体，研究不同植物病毒编码的沉默抑制子的活性。I、PEG遗传转化
1.1将制备好的甘蔗CP72-1210愈伤组织原生质体冰浴30 min，去除W5溶液，用1_2mL MMG溶液悬浮原生质体浓度至每毫升2 X IO5个。I. 2 分别取 5 μ L 的 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi-P19_Nos 质粒 DNA (I μ g/μ 1),5μ L 的 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi- y b-Nos 质粒 DNA (I μ g/ μ I )，5 μ L 的 pUbi-EYFP - Nos和 pUbi-Nos 质粒 DNA (I μ g/ μ I)到 2 mL 离心管。1.3加入100 μ L甘蔗CP72-1210原生质体，混合后，加入110 yL 40%聚乙二醇溶液(PEG-4000)，混匀，室温温浴5-15 min。1.4加入440 uL W5溶液，混匀，终止遗传转化，100 g离心2 min。弃上清液，I mLWI溶液悬浮原生质体，然后移入6孔的细胞培养板，室温放置24 h。MMG 溶液4 mmol/L MES+0. 4 mol/L 甘露醇 +15 mmol/L 氯化镁，pH 5. 7。WI 溶液4 mmol/L MES+0. 5 mol/L 甘露醇 +20 mmol/L 氯化钾，pH 5· 7。聚乙二醇转化液40%(W/V)聚乙二醇(PEG4000)+0. 2 mol/L 甘露醇+100 mmol/L氯化钙。2、在荧光显微镜下(YFP荧光滤片)观察表达EYFP原生质体数目，如图2、图3和图4所示，不同植物病毒编码的沉默抑制子的活性，表现为P19和Yb沉默抑制子可以提高外源基因EYFP表达水平，平均增幅分别达63%和56%。实例3 :利用从甘蔗品种CP72-1210心叶愈伤组织分离、纯化的原生质体，研究不同启动子的活性。I、转基因瞬时表达
1.1将制备好的甘蔗CP72-1210愈伤组织原生质体冰浴30 min，去除W5溶液，用1_2mL MMG溶液悬浮原生质体浓度至每毫升2 X IO5个。I. 2 分别取 10 μ L 质粒 DNA (pPr4-GUS-N0S、pUbi-GUS-NOS、p35S-GUS-N0S，10μ g)到2 mL离心管中，设空载体(pUbi-NOS)、水为空白对照。1.3加入100 μ L原生质体，混合后，加入110 μ L 40 %聚乙二醇转化液，混匀，室温温浴5-15 min。1.4加入440 μ L W5溶液轻轻混匀，终止遗传转化，100 g离心2 min。弃上清液，I mL WI溶液悬浮原生质体，然后移入6孔的细胞培养板，室温放置24 h。2、⑶S活性测定
2.1将甘蔗CP72-1210愈伤组织原生质体装入I. 5 mL离心管，100 g离心2 min，弃上清液，取25 μ L等量原生质体分装到I. 5 mL离心管。2.2加入25 μ L MUG底物反应液，37 °C反应60 min。
2.3加入950 μ L碳酸钠溶液(O. 2 mol/L)终止反应。2.4用荧光分光光度计测定荧光强度。2. 5原生质质体总蛋白含量采用考马斯亮蓝法(Bradford法)。2.6 4-MU标准曲线的绘制
在O. 2 mol/L碳酸钠溶液的终止液中加入4-MU，配成不同4-MU浓度的溶液，然后利用荧光分光光度计测其产生的荧光(激发光365 nm,发射光455 nm)，绘制标准曲线。2. 7⑶S活性计算
GUS活性用每微克蛋白每分钟形成的4-MU的pmol表示，计算公式为⑶S活性=MUG分解形成的4-MU (pmol) + [可溶解性蛋白(μ g) X反应时间(min)]。实验重复3次。GUS缓冲液50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0),10 mmol/L β-巯基乙醇，10 mmol/L 乙二胺四乙酸(pH 8. 0),0. 1% (v/v) Triton X-IOO0 MUG底物反应液2 mmol/L MUG溶解于⑶S缓冲液。 2.8不同启动子活性差异如图5所示，不同启动子活性有所差异，启动子活性依次为 Pr4、Ubi、35S，其驱使 GUS 活性分别为 40. 86、15. 71,4. 99 pmol 4-MU/ μ gprotein · min。
权利要求
1.一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下 (1)甘蔗愈伤组织培养 取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1-2 Cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28°C暗培养1-2个月，每隔2周继代I次；所述MS3固体培养基为MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3mg/L 2, 4-D+30 g/L 鹿糖 +6. O g/L 琼脂粉；MS 培养基为 1962 年,Murashige 和 Skoog 公开的MS培养基； (2)甘蔗悬浮细胞培养 将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28 0C暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10-15 min,吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28 V暗培养1-2月，每隔I周继代I次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基:MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，去离子水补足I升； (3)甘蔗原生质体的分离 取步骤(2)的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，100 g离心2 min;弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100 g离心2 min ;弃上清液，取悬浮细胞2-3 g加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液O.02 mol/L MES+0. 4 mol/L甘露醇+0. 02 mol/L氯化钾，pH 5. 7 ;所述酶解反应液2 %纤维素酶+0.1 %果胶酶+0.01 mol/L氯化钙+0. I %牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比； (4)甘蔗原生质体的纯化 用无菌水清洗70 μ m孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤(3)获得的原生质体转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min ;弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心I min ;弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体；所述W5溶液2 mmol/L MES+154mmol/L 氯化纳+125 mmol/L 氯化|丐+5 mmol/L 氯化钾，pH 5.7。
2.由权利要求I的方法分离与纯化的甘蔗愈伤组织原生质体在甘蔗转基因瞬时表达中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化。利用本发明的方法可以快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。
文档编号C12N5/04GK102899282SQ20121039187
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者高三基, 米尔科夫艾瑞克, 朴钟元, 陈如凯, 傅华英, 付为林, 林艺华, 吴小斌 申请人:福建农林大学