专利名称：甘蔗赤条病菌巢式pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植物病菌PCR检测方法,具体涉及甘鹿赤条病菌dit/orararavenae subsp. areflae)巢式PCR检测方法,属生物技术领域。
背景技术：
甘鹿赤条病属于甘鹿细菌性病害，病菌为Acidovorax avenae subsp.avenae, 1890年首次报道在夏威夷发生，1923年澳大利亚的局部地区发生此病，造成严重损失。该病是一种在全世界甘蔗种植区域频繁爆发的一种毁灭性甘蔗病害，病害有叶条斑和顶腐两种类型。两者可以单独发生，亦可并发。叶条斑型一般多发生于嫩叶叶片中部，靠近中脉部位。最初表现为水溃状绿条，绿条两端迅速扩展成长条状红色至红褐色病斑。顶腐型表现为老叶黄化、枯萎、其早期症状是甘蔗生长点附近的维管束变红、腐烂，进一步发展，导致节间大腔穴的形成，后期心叶腐烂，可以从外面包着的叶鞘中拉出来，并具有一种 特殊的难闻臭味。甘蔗赤条病菌在田间主要靠风、雨传播。在潮湿温暖的条件下容易发病，而且病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物，借助雨水和气流传播。患病的枯老蔗叶、病茎中的病原菌经4个月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤条病菌的快速、准确、灵敏的检测技术，对该病的防治起到十分关键的作用，同时，也为甘蔗赤条病抗病鉴定和甘蔗引种检疫提供技术参考。常用的检测病菌的方法有生物学鉴定法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。生物学鉴定法耗时、且步骤繁琐；电镜技术需要植物组织切片，步骤繁琐，且只能通过形态学观察判断；酶联免疫技术需要特异性的抗血清，且灵敏度不及分子检测技术；基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，在其它甘蔗病原物的检测已得到广泛应用。目前甘蔗赤条病菌的PCR检测方法未见报到。在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，目前16S rDNA的序列信息已经广泛应用于菌种分子鉴定和系统发生学研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，以克服现有技术中的不足之处。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第I轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测；其特征在于
(I)引物设计扩增甘蔗赤条病菌的引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSD-FI和SRSD-Rl的序列如下
SRSD-16S-F1 :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
SRSD-R2 :5’ -TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT-3’ ；
SRSD-Fl :5’ -ACGGTAACAGGTCTTCGGA-3’SRSD-Rl :5’ -CAGTTGACATCGTTTAGGGC-3’ ；
(2)第I轮PCR扩增PCR扩增体系为总体积50μ L，内含5. O μ L 10XPCR缓冲液，4. O μ L 2. 5 mmol/L dNTPs, 10 μ mol/L 引物 SRSD-16S-F1 和 SRSD-R2 各 2· O μ L,0. 25 UTaq DNA Polymerase, 500 ng甘鹿叶片基因组DNA, ddH20补足到50 μ L ； PCR扩增程序如下94 °C预变性3 min,94 °C变性45 S、55 60 °C退火30 S、72 °C延伸60 S，共30 35个循环，最后72 °C再延伸7 min ;所述10XPCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)，15 mmol/L MgCl2 ；
(3)第2轮PCR扩增:PCR扩增体系为总体积50μ L，内含5.0 μ L 10XPCR缓冲液，4. O μ L 2. 5 mmol/L dNTPs, 10 μ mol/L 引物 SRSD-F1 和 SRSD-Rl 各 2· O μ L,0. 25 U TaqDNA Polymerase,第一轮 PCR 产物稀释 100 倍后取 1.0 μ L, ddH20 补足到 50 μ L ；PCR 扩增程序如下94 °C预变性3 min,94 °C变性45 S、53 57 °C退火30 S、72 °C延伸45 S，共30 35个循环，最后72 °C再延伸7 min ；
(4)电泳检测出现一条分子量为755bp的核酸带的样品，为感染甘蔗赤条病菌的植 株叶片样品。本发明的优点是，以感病甘蔗叶片DNA为模板，根据甘蔗赤条病菌的16S核糖体核苷酸序列设计的特异性引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSDFl和SRSDR1，采用巢式PCR的方法，可以方便、特异、灵敏的检测甘蔗赤条病菌，比常规PCR检测灵敏度提高了 1000倍。
图I是甘蔗赤条病菌的PCR检测电泳图，其中，I为2000 bp DNA标准相对分子质量，2为感染赤条病菌的甘蔗叶片样品，3为健康甘蔗叶片样品，4为ddH20。
具体实施例方式 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。I、甘蔗叶片DNA提取
①取叶片100 mg，用液氮迅速研磨成粉末，置2 mL离心管中。②加入900 uL 2 X CTAB缓冲液和100 uL的无水乙醇，涡旋至充分溶解。③离心管置于65 °C水浴60 min，每隔5-10 min颠倒混匀，使CTAB充分裂解细胞，取出后12000 rpm,离心5 min。④取上清液于新的2 mL离心管中，并加入等体积的苯酚氯仿异戊醇25:24:1 ；混勻，12000 rpm 离心 10 min。⑤取上清液于新的I. 5 mL离心管中，并加入等体积的氯仿异戊醇24:1 ;混匀，12000 rpm 离心 10 min。⑥取上清液，置新的I. 5 mL离心管中，并加入1/10体积预冷的3 mol/L NaAC(pH=5. 2)使DNA充分沉淀，混匀，加等体积-20 1预冷的异丙醇，晃匀，置于_20 °C放置30 min。⑦4 0C 10000 rpm离心5 min，去液相，加1000 uL预冷75 %乙醇洗沉淀两次，再用无水乙醇洗一次，倒置离心管，室温干燥DNA。⑧加入40 uL ddH20,并在37 V中保温直至DNA完全溶解。⑨用分光光度计检测DNA质量及DNA浓度后置4 °C中备用，或置_20 °C长期保存。
2、引物设计
根据甘鹿赤条病菌avenae subsp. avenae^) 16S rRNA核苷酸序列设计特异性引物对SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSD-FI和SRSD-R1，扩增的目的核酸带大小为755bp，引物序列如下
SRSD-16S-F1 :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
SRSD-R2 :5’ -TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT-3’ ；
SRSD-Fl :5’ -ACGGTAACAGGTCTTCGGA-3’
SRSD-Rl :5’ -CAGTTGACATCGTTTAGGGC-3’。3、第I轮PCR扩增 在PCR管中加入以下试剂
权利要求
1. 一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第I轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测；其特征在于 (1)引物设计扩增甘鹿赤条病菌(Acidovoraxavenae subsp. avenae )的引物SRSD-16S-F1 和 SRSD-R2、SRSD-Fl 和 SRSD-Rl 的序列如下SRSD-16S-F1 :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SRSD-R2 :5’ -TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT-3’ ；SRSD-Fl :5’ -ACGGTAACAGGTCTTCGGA-3’SRSD-Rl :5’ -CAGTTGACATCGTTTAGGGC-3’ ； (2)第I轮PCR扩增=PCR扩增体系为总体积50μ L，内含5. O μ L 10XPCR缓冲液，.4. O μ L 2. 5 mmol/L dNTPs, 10 μ mol/L 引物 SRSD-16S-F1 和 SRSD-R2 各 2· O μ L,0. 25 UTaq DNA Polymerase, 500 ng甘鹿叶片基因组DNA, ddH20补足到50 μ L ； PCR扩增程序如下94 °C预变性3 min、94 °C变性45 S、55 60 °C退火30 S、72 °C延伸60 S，共30 35个循环，最后72 °C再延伸7 min ;所述10XPCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)，15 mmol/L MgCl2 ； (3)第2轮PCR扩增:PCR扩增体系为总体积50μ L，内含5.0 μ L 10XPCR缓冲液，.4.O μ L 2.5 mmol/L dNTPs，10 μ mol/L 引物 SRSD-F1 和 SRSD-Rl 各 2· O μ L,0. 25 U TaqDNA Polymerase，第一轮 PCR 产物稀释 100 倍后取 1.0 μ L, ddH20 补足到 50 μ L ；PCR 扩增程序如下94 °C预变性3 min,94 °C变性45 S、53 57 °C退火30 S、72 °C延伸45 S，共30 35个循环，最后72 °C再延伸7 min ； (4)电泳检测出现一条分子量为755bp的核酸带的样品，为感染甘蔗赤条病菌的植株叶片样品。
全文摘要
本发明涉及一种甘蔗赤条病菌(Acidovoraxavenaesubsp.avenae)的巢式PCR检测方法，以感病的甘蔗叶片DNA为模板，根据甘蔗赤条病菌的16SrRNA核苷酸序列设计的特异性引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSDF1和SRSDR1，采用巢式PCR扩增方法，检测甘蔗赤条病菌。本发明的甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，克服了生物学鉴定、电镜技术、酶联免疫技术、常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、灵敏的甘蔗赤条病菌的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102864244SQ20121039202
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者高三基, 黄莺英, 陈如凯, 傅华英, 林艺华, 付为林, 陈平华, 王恒波 申请人:福建农林大学