专利名称：一株地衣芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
随着人们对健康和生态环境的高度重视，无毒、无残留及无抗药性的绿色饲料添加剂成为研究热点。益生菌是有利于宿主肠道微生物平衡的活菌食品或饲料添加剂，要求抗消化道内环境，定植于消化道表面，产生有用的酶类和有机酸等代谢产物，在加工和贮存过程中保持活性等。作为绿色饲料添加剂的益生菌种类很多。美国FDA (1989)认为，安全的微生物菌株共42种，农业部658公告中公布了 16种，地衣芽孢杆菌(Bacillusclicheniformis)是其中一种。地衣芽孢杆菌主要通过以下几方面发挥作用1)颉颃动物病原细菌并维持和调整·肠道微生态平衡。2)产生多种酶类并提高动物消化酶活性，促进动物对营养物质的消化吸收。3)增强动物体的免疫功能，抵御感染。研究证明，地衣芽孢杆菌确实是一种高效且安全的新型饲料添加剂。目前，国内的研究多集中于研制产品和应用效果，而按益生菌的特定要求来选育性能优良的菌种，研究菌株生物特性方面的报道很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2，该菌株已于2011年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo. 5350。本发明的另一个目的是提供一种地衣芽孢杆菌制剂。该地衣芽孢杆菌制剂除包含作为活性成分的地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350外，还可包括辅料，如稻壳粉、麦芽糊精、石粉、豆柏
坐寸ο本发明的再一个目的是提供一种动物饲料添加剂。该动物饲料添加剂的活性成分为所述地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350。含有所述动物饲料添加剂的动物饲料也属于本发明的保护范围。本发明的又一个目的是提供一种抑菌产品。该抑菌产品的活性成分为所述地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350。本发明所提供的地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350在如下至少一种中的应用也属于本发明的保护范围a)制备地衣芽孢杆菌制剂；
b)制备动物饲料添加剂；c )制备动物饲料；d)制备抑囷广品；e)促进猪或者鸡生长。在本发明的一个实施例中,所述动物具体为猪或鸡。所述促进动物生长具体可体现在如下I)或2):I)提高动物猪平均日增重、提高猪平均日采食量、提高猪皮毛指数、降低猪料肉比和/或降低猪腹泻率；2)提高鸡平均日增重和/或提高平均日采食量。 制备所述地衣芽孢杆菌制剂的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤I)发酵地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350，浓缩发酵液，得到菌泥；2)将步骤I)得到的菌泥与麦芽糊精混匀，即得到地衣芽孢杆菌制剂。在上述方法步骤I)中，所述发酵地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，浓缩发酵液，得到菌泥，具体为通过将所述地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350的发酵液进行蒸发，至含水量50_60%，得到所述菌泥。在上述方法步骤I)中，所述发酵的温度为15°C _45°C，所述发酵的时间为10_30小时，所述发酵所需的PH值为6. 4-6. 6，所述发酵的压力为O. 08Mpa-0. 14Mpa，发酵过程中的通气量为O. 8-1. OV / V ·π η，所述通气量以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积来表不。在本发明的一个实施例中，所述发酵的温度具体为30°C、15°C或45°C，所述发酵的时间具体为28-30小时、10小时或18小时。在上述方法步骤2)中，所述菌泥与所述麦芽糊精的配比为(3-8) XlO11Cfu :lg。在上述方法步骤I)中，所述发酵采用的培养基按照如下方法制备将蔗糖、豆柏、NaCUK2HPO4^KH2PO4 · 3H20、MnSO4、MgSO4 · 7H20和水混匀，得到培养基，所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述豆柏在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述NaCl在所述发酵培养基中的浓度为lg/L-5g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度为O. lg/L-0. 5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述发酵培养基中的浓度为O. 05g/L_0. 5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度为O. lg/L-0. 5g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述发酵培养基中的浓度为O. O lg/L-0. lg/L。在本发明的实施例中，上述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L或45g/L，所述豆柏在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L或45g/L，所述NaCl在所述发酵培养基中的浓度具体为lg/L、2g/L或5g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度具体为O. Ig/L、0. 4g/L或O. 5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述发酵培养基中的浓度具体为O. Ig/L、0. 4g/L或O. 5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度具体为O. lg/L、或O. 5g/L，所述MgSO4 ·7Η20在所述发酵培养基中的浓度具体为O. O lg/L或O. 05g/L ;所述发酵培养基的 pH 为 6. 0-6. 8，或 6. 0-6. 4，或 6. 6-6. 8。
在上述方法中，在所述步骤2)后，还包括将乳化产物干燥得到地衣芽孢杆菌制剂的步骤，其中干燥采用低温真空干燥箱在低温温度27-50°C，真空度-O. 096Mpa条件下进行。制备所述动物饲料添加剂的方法也属于本发明的保护范围。该方法与上述制备所述地衣芽孢杆菌制剂的方法相同，也包括如下步骤I)发酵地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350，浓缩发酵液，得到菌泥；2)将步骤I)得到的菌泥与麦芽糊精混匀，即得到动物饲料添加剂。在上述的动物饲料添加剂制备方法中，所述动物具体可为猪或鸡。制备所述抑菌产品的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤发酵所述地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，收集发酵产物，得到所述抑菌产品。在上述抑菌产品的制备方法中，所述发酵的温度可为35V -37°C。在本发明的一个实施例中具体为37 °C。在上述抑菌产品的制备方法中，所述发酵时间可为15h_80h。在本发明的一个实施例中具体为30h或20h。在上述抑菌产品的制备方法中，所述发酵的培养基具体为MRS肉汤培养基；所述MRS肉汤培养基的pH值为6. 0-6. 4。所述地衣芽孢杆菌制剂在作为动物饲料添加剂或抑菌产品中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明中，所有所述抑菌产品均具体可为药物或菌剂；所述抑菌均具体可为抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、化脓杆菌(Bacillus pyogenes)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)、藤黄球菌(Micrococcus luteus)、月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)和幾肠球菌(Enterococcus faecalis)中的至少一种。在本发明中，所有所述动物均具体可为猪或鸡。本发明通过分离、鉴定、筛选，得到地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，其抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性，本发明将其进行乳化制备得到地衣芽孢杆菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、鸡、牛、羊等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350主要作为动物饲料的添加剂，可替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪以及生长育肥猪的生产性能。本发明的地衣芽孢杆菌对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的地衣芽孢杆菌无耐药性和药物在动物产品中残留，不会对人类的健康产生潜在的危害，是一种有前途的绿色饲料添加剂。
图I 为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的耐酸性
检测结果。图2 为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的耐胆盐
检测结果。图3为测定蛋白酶活性的酪氨酸标准曲线。图4 为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的生长曲 线。保藏说明菌种名称地衣芽孢杆菌拉丁名(BacillusLicheniformis)菌株编号C30_2保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2011年09月30日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5350
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的培养基如无特殊说明配方如下( I) MRS肉汤培养基蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐温801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨2g，七水硫酸镁O. 2g,四水硫酸锰O. 05g，酵母粉4g，用蒸馏水定容至lL，pH 6. 0-6. 4。(2) MRS琼脂培养基IL上述的MRS肉汤培养基中加入琼脂15g，pH6. 3-6. 7。(3) Ml7琼脂培养基大豆蛋白胨5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白胨5g,抗坏血酸O. 5g,牛肉浸膏2. 5g,β -甘油磷酸二钠19g，MgS04 · 7H20 O. 25g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，ρΗ6· 6-6. 9。实施例I、地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2的分离及鉴定一、菌株C30-2的分离与筛选I、菌株的分离培养取Ig中国北京的农田土壤样品于装有9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为I :10稀释液，再取稀释液进行十倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各ImL涂布于含有IOppm放线菌酮的MRS琼脂培养基及M17琼脂培养基，37°C厌氧培养48 72h,观察并记录菌落形态，挑取长势良好的特征单菌落于MRS肉汤培养基中，进行划线分离纯化。观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的菌悬液放置4°C冰箱贮藏，进一步进行下述紫外诱变筛选实验。2、菌株的紫外诱变与筛选将经灭菌的固体LB培养基倒入底部平整的平皿中，待凝固后取适量步骤I制备的菌悬液涂布于平板上，培养12h后，在距离20cm的紫外灯下诱变30s。获得诱变后的菌株。挑选诱变后的菌株接种于LB液体培养基中培养24h，然后取适量诱变后的菌悬液涂布于平板上，每平皿控制菌落在30-50个，在37°C下继续培养至24h (各菌落产生的代谢产物最大量时)，将琼脂块取出置于涂布有金黄色葡萄球菌的检测平皿上，37°C培养一段时间，以野生地衣芽孢杆菌为对照，测量并比较琼脂块周围形成的抑菌圈大小。对抑菌能力明显增大的菌株(抑菌圈大约IOmm)进一步通过琼脂孔扩散法测定菌株的抑菌能力。选取抑菌圈在15_以上的菌株进一步进行革兰氏染色实验。
3、菌株的革兰氏染色用无菌注射器吸取少量含有步骤2所得菌株的MRS肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 :7，体积比)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染lmin，水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，若菌体呈红色为阴性，呈紫色为阳性。选取呈革兰氏阳性，且形态一致的杆菌，进一步进行下述接触酶试验。4、菌株的接触酶试验做MRS斜面培养基，取含有步骤3所得菌株的MRS肉汤培养物约O. 2 mL注入装有MRS琼脂培养基斜面，5%C02培养箱，37°C培养24h，长出菌落后，将3%过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过步骤1-4的分离与筛选最终获得I株对金黄色葡萄球菌抑制能力明显增强，革兰氏染色成阳性，接触酶反应也为阳性的菌株。将该菌株编号为C30-2。二、菌株C30-2的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一分离并筛选得到的菌株C30-2具体属于哪种菌。I、形态学鉴定一方面，将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并筛选得到的菌株C30-2进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的所述菌株C30-2，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。分离并筛选得到的菌株C30-2的细胞为杆状，细胞直径大于I μ m，有芽孢形成，芽孢不膨大，革兰氏染色阳性。2、生理生化特征测定菌株C30-2的生理生化特征测定结果如表I所示表I菌株C30-2的生理生化特征
权利要求
1.地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5350。
2.一种地衣芽孢杆菌制剂，其活性成分为权利要求I所述的地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
3.一种动物饲料添加剂，其活性成分为权利要求I所述地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
4.含有权利要求3所述动物饲料添加剂的动物饲料。
5.一种抑菌产品，其活性成分为权利要求I所述地衣芽孢杆菌(B a c i 11 u sLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
6.权利要求I 所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2CGMCC No. 5350在如下至少一种中的应用 a)制备地衣芽孢杆菌制剂； b)制备动物饲料添加剂； c)制备动物饲料； d)制备抑囷广品； e)促进猪或者鸡的生长。
7.一种制备地衣芽孢杆菌制剂的方法，包括如下步骤 1)发酵地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，浓缩发酵液，得到菌泥； 2)将步骤I)得到的菌泥与麦芽糊精混匀，即得到地衣芽孢杆菌制剂。
8.一种制备动物饲料添加剂的方法，包括如下步骤 1)发酵地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，浓缩发酵液，得到菌泥； 2)将步骤I)得到的菌泥与麦芽糊精混匀，即得到动物饲料添加剂。
9.一种制备抑菌产品的方法，包括如下步骤发酵权利要求I所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，收集发酵产物，得到所述抑菌产品。
10.权利要求2所述地衣芽孢杆菌制剂在作为动物饲料添加剂或抑菌产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5350。实验证明，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No.5350抗逆性强、抗杂菌能力强，本发明将其进行乳化制备得到地衣芽孢杆菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，可替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率。
文档编号C12N1/20GK102876614SQ201210392858
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者谯仕彦, 丁修良, 王劲松, 宋青龙, 张海燕 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司