专利名称：检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因qHUS6的特异性PCR分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于水稻育种技术领域，特别涉及检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因qHUS6的特异性PCR分子标记。
背景技术：
水稻是典型的吸硅作物，硅在水稻生长发育过程中具有重要作用。高硅水稻品种在生长过程中可有效减轻各种生物和非生物协迫，改善对稻瘟病和纹枯病的抗性，提高抗倒伏能力与抗旱性。高硅水稻品种的培育一般通过应用高硅水稻材料、采用杂交选育获得，而硅在水稻中特别是颖壳中的含量须在水稻成熟收获后才能检测，无法通过传统的田间表型观察进行选择。 随着分子标记的快速发展，借助分子标记辅助选择，可以在任ー阶段检测控制硅含量的基因，鉴定对硅积累增效的等位基因是否已导入受体品种，选育高硅水稻品种。分子标记辅助选择育种的开展需具备三个条件
(1)供体未本携带效应明确、已精细定位或克隆的目标基因；
(2)已开发出与目标基因紧密连锁且检测简便的标记；
(3)连锁标记在供体和受体亲本之间呈多态。前期研究表明，在水稻第6染色体上克隆了一个控制水稻硅含量的ヴ规/洛基因，其增效等位基因来源于水稻品种密阳46。本发明在此基础上对^M/洛基因及其紧密连锁区间进行测序，根据测序结果设计基因功能和序标位(STS)标记，并从中挑选出可特异性鉴定密阳46等位基因的标记。本发明提供的分子标记对密阳46中高硅含量等位基因qHUS6的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于密阳46高硅含量等位基因_S6的转育研究中。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了 16个检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因QHUS6的特异性分子标记。本发明采用以下技术方案
根据前期的K依的克隆结果，对基因及其紧密连锁区间进行测序，将测序结果与已公布的梗稻品种Nipponbare和軸稻品种93-11的基因组序列进彳丁比对，根据目标序列的摘入和缺失情況，设计了 53个与qHUS6紧密连锁的STS标记。将这53个STS标记用于检测定位群体亲本珍汕97B和密阳46，筛选出16个在水稻品种密阳46中检测到特异片段的标记。这16个标记可用于鉴定待测材料是否在^M/洛座位上携帯水稻品种密阳46控制水稻硅含量的等位基因。检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因^M/洛的特异性PCR分子标记，包含16个特异性标记 Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927Cl、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946 的引物各ー对Si2925A的上游引物序列为5’ -TTGGCTAGCTTAACCTTCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列；Si2925A的下游引物序列为5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Si2925B的上游引物序列为5’ -CATCTGTGTCACTGTTTGGCT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；Si2925B的下游引物序列为5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
Si2926A的上游引物序列为5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；Si2926A的下游引物序列为5’ -TAACATATCTGATCGGTGCCTA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
Si2926B的上游引物序列为5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 7的所示核苷酸序列；Si2926B的下游引物序列为5’-ACCAGGAATATCGGTGACCA-3’，所述 核苷酸序列为SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；
Si2927A的上游引物序列为5’-AGACCTGCCTAGCTGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:9的所示核苷酸序列；Si2927A的下游引物序列为5’-AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列；
Si2927B的上游引物序列为5’ -CATGCAGGCTCTTAAGTGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 11的所示核苷酸序列；Si2927B的下游引物序列为5’ -AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列；
Si2927Cl 的上游引物序列为 5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；Si2927Cl的下游引物序列为5’-TCATTCTGATAGCTTTGTCCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；Si2927C2的上游引物序列为5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 15的所示核苷酸序列；Si2927C2的下游引物序列为5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；
Si2927C3的上游引物序列为5’ -AACTTGGGACAAAGCTATCAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQID NO: 17的所示核苷酸序列；Si2927C3的下游引物序列为5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列；
Si2933A的上游引物序列为5’ -AGACGCTCATATTCAACAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 19的所示核苷酸序列；Si2933A的下游引物序列为5’-TAAAGCGCAATCAGACT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:20所示的核苷酸序列；
Si2933B的的上游引物序列为5’-AGTACTACATACCCCTATCCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:21的所示核苷酸序列；Si2933B的下游引物序列为5’-AATATATGTATAGACCACGCGCACT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；
Si2933C 的上游引物序列为 5’-GAAAATATATACTAGCAATCCTCGCAAA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 23的所示核苷酸序列；Si2933C的下游引物序列为5’-CATAGGCTTGCATCCAGACTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；Si2936 的上游引物序列为 5’-AAACTTAAAGAAAITTGACTATGAAA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 25的所示核苷酸序列；Si2936的下游引物序列为5’-AACAAGATCTGATCAACTTCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；
512939的上游引物序列为 5’-GGTAAATTGTCTTTCCATACTAITG-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 27的所示核苷酸序列；Si2939的下游引物序列为5’-AATTATTTGGAGGAGCGTATC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；
512940的上游引物序列为 5’-ACACTCAITTCAAGAITCAACTT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 29的所示核苷酸序列；Si2940的下游引物序列为5’ -GCCAATATAAACAAGGTTACTACTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；
Si2946的上游引物序列为5’ -ATGCCMTTGAGTTTCGTTCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:31的所示核苷酸序列；Si2946的下游引物序列为5’ -CATGACATCGACGCGAAGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。 16 个标记的 PCR 扩增均采用如下体系Tris-HCL(pH 8. 8)33. 5 mM, (NH4)2SO4 8. 0mM，MgCl2 I. 5 mM, TWEEN-20 0. 05%, dNTPs 0. 2 mM，上、下游引物各 3. 3 ng/m, Taq DNA 聚合酶2.0单位，模版DNA 50 ng。PCR反应条件除退火温度外其它一致，具体參数为94°C2 分钟；94°C 45 秒、50-60。。(Si2940 为 60°C，Si2939 和 Si2946 为 55°C，其余 13 个标记皆为50°C ) 45秒、72°C I分钟，30个循环；72°C 8分钟。四
图I为Si2926A对192个分离材料的检测结果图。其中，M:分子量标记；ZS :珍汕 97B ；MY :密阳 46 ;S1、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、S36、S40 为筛选出的 20 个呈珍汕 97B 纯合型的单株；S5、S6、S7、S10、Sll、S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、
S35、S37、S38、S39为筛选出的20个呈密阳46纯合型的单株。图2为40个纯合型株系的硅含量检测结果图。其中，，纵坐标为硅百分含量，横坐标为株系；20个珍汕97B纯合型株系(SI、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、S36、S40)(硅含量用未填充的柱状图表示)的硅含量显著0° < 0. 01)低于20个密阳46纯合型株系(S5、S6、S7、S10、Sll、S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、S35、S37、S38、S39)(硅含量用黒色填充的柱状图表示)。五具体实施例方式 I、密阳46高硅含量等位基因_S6的特异性PCR分子标记的筛选根据前期的克隆结果，对的汉依及其紧密连锁区间进行测序，将测序结果与已公布的粳稻品种日本睛和籼稻品种93-11序列进行比对，分析日本睛和93-11序列间的插入和缺失，设计了沿ヤqHUS6功能标记及紧密连锁的STS标记，应用下述步骤检测定位群体亲本珍汕97B和密阳46，筛选出16个在密阳46检测到特异片段的标记。(I)DNA提取将珍汕97B和密阳46的种子分别置于预先标号的培养皿，30°C发芽7天，采用简易法从幼苗中提取DNA。(2) PCR扩增采用20 W反应体系，反应条件如上所述，在PCR仪上进行扩增。(3) PCR产物电泳及显色扩增产物中加入加样缓冲液，每样品取2 m上样于6%非变性聚丙烯酰胺胶(PAGE);接通电极，在IOOV恒定电压下电泳4小吋，关闭电源；取下凝胶，银染显色。如图I所示所筛选出的标记能从分离群体中筛选携帯^M/洛不同等位基因的单株，其中，SI、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、
S36、S40 表现为珍汕 97B 纯合型，S5、S6、S7、S10、SlU S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、S35、S 37、S38、S39 表现为密阳 46 纯合型。2、特异性PCR标记对密阳46高硅含量等位基因_S6鉴定效果的验证
收获40个获选单株上的种子，2010年在中国水稻研究所实验基地以株系种植，设2个重复。成熟后每个重复每个株系取中间5株的谷粒于55°C - 60°C烘48小时，经垄谷机对谷粒脱壳，并将谷壳置于55°C - 60°C烘干处理24小时，然后用旋风磨粉仪对谷壳进行打磨，并将磨制的粉样放置于60°C烘箱烘干至恒重，最后采用钥蓝比色法測定各样品的硅含量，単位为％。每样品测两次，取平均值。从图I、图2结果显示，基因型鉴定和硅含量检测结果完全一致，20个珍汕97B纯合型株系的硅含量(硅含量用未填充的柱状图表示)显著Gd < 0. 01)低于20个密阳46纯合型的株系(硅含量用黒色填充的柱状图表示)。结果表明，本发明提供的分子标记可有效地检测材料是否携带密阳46的高硅含量等位基因qHUS6。
权利要求
1.检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因_S6的特异性PCR分子标记，包含16个特异性标记 Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927Cl、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946 的引物各ー对Si2925A的上游引物序列为5’ -TTGGCTAGCTTAACCTTCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列；Si2925A的下游引物序列为5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； Si2925B的上游引物序列为5’ -CATCTGTGTCACTGTTTGGCT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；Si2925B的下游引物序列为5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； Si2926A的上游引物序列为5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 5所示的核苷酸序列；Si2926A的下游引物序列为5’ -TAACATATCTGATCGGTGCCTA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； Si2926B的上游引物序列为5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 7的所示核苷酸序列；Si2926B的下游引物序列为5’-ACCAGGAATATCGGTGACCA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列； Si2927A的上游引物序列为5’-AGACCTGCCTAGCTGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；Si2927A的下游引物序列为5’-AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； Si2927B的上游引物序列为5’ -CATGCAGGCTCTTAAGTGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 11的所示核苷酸序列；Si2927B的下游引物序列为5’ -AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列； Si2927Cl 的上游引物序列为 5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；Si2927Cl的下游引物序列为5’-TCATTCTGATAGCTTTGTCCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；Si2927C2的上游引物序列为5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 15的所示核苷酸序列；Si2927C2的下游引物序列为5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列； Si2927C3的上游引物序列为5’ -AACTTGGGACAAAGCTATCAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQID NO: 17的所示核苷酸序列；Si2927C3的下游引物序列为5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列； Si2933A的上游引物序列为5’ -AGACGCTCATATTCAACAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 19的所示核苷酸序列；Si2933A的下游引物序列为5’ -TAAAGCGCAATCAGACT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:20所示的核苷酸序列； Si2933B的的上游引物序列为5’-AGTACTACATACCCCTATCCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:21的所示核苷酸序列；Si2933B的下游引物序列为5’-AATATATGTATAGACCACGCGCACT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列； Si2933C 的上游引物序列为 5’-GAAAATATATACTAGCAATCCTCGCAAA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 23的所示核苷酸序列；Si2933C的下游引物序列为5’-CATAGGCTTGCATCCAGACTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列； Si2936 的上游引物序列为 5’-AAACTTAAAGAAAITTGACTATGAAA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 25的所示核苷酸序列；Si2936的下游引物序列为5’-AACAAGATCTGATCAACTTCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列； 512939的上游引物序列为 5’-GGTAAATTGTCTTTCCATACTAITG-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 27的所示核苷酸序列；Si2939的下游引物序列为5’-AATTATTTGGAGGAGCGTATC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列； 512940的上游引物序列为 5’-ACACTCAITTCAAGAITCAACTT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 29的所示核苷酸序列；Si2940的下游引物序列为5’ -GCCAATATAAACAAGGTTACTACTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 30所示的核苷酸序列；Si2946的上游引物序列为5’ -ATGCCAATTGAGTTTCGTTCAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:31的所示核苷酸序列；Si2946的下游引物序列为5’ -CATGACATCGACGCGAAGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了检测水稻品种密阳46高硅含量等位基因qHUS6的16个特异性PCR分子标记，分别为Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927C1、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946的PCR引物。利用这16个标记对水稻苗期所提取的DNA进行鉴定，可以检测待测材料是否转入水稻品种密阳46的高硅含量等位基因qHUS6，即是否具有提高水稻硅含量的能力，整个检测过程操作简单且准确性高。
文档编号C12Q1/68GK102864245SQ20121039283
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者应杰政, 樊叶杨, 庄洁云, 朱玉君 申请人:中国水稻研究所