专利名称：一种快速提取水稻dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速提取水稻DNA的方法。
背景技术：
基于PCR技术为基础的分子标记已广泛地运用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分 析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。尤其是，DNA分子标记辅助选择 育种已成为分子技术在作物改良中的一个重要应用，即通过对与表型紧密连锁的DNA分子 标记的筛选，以快速获取带目的表型的理想植株。随着生物技术的不断发展、水稻基因组测 序的完成、功能基因鉴定的日益增多，分子标记辅助选择育种越来越多地应用于作物新品 种改良。为了应用PCR检测技术，人们需要从组织样品中提取DNA。然而，DNA提取是一项 耗费人力、物力的繁琐工作，提取的DNA也仅在筛选、鉴定时使用了很少的一部分，剩余的 大部分DNA将作为累赘而被废弃。尽管人们也一直致力于DNA抽提方法的探讨，但目前应 用的主要方法仍然烦琐费时。因此，在大规模的基于PCR的基因型检测作业中，高效、快速、 简便的模板DNA制备显得非常重要。目前已公开的一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法(王兰、龙云铭、刘耀 光，分子植物育种.2009，7 (2) 425-428)，存在着如下缺陷1、操作较费时，仅破碎组织样品的时间就需要5min ；2、仅能以叶片为原料进行提取，且最少要求有4mg的叶片；因此原料的适应性较 差；3、所得的DNA溶液主要用于短期使用用TE制备的DNA在4°C下可保存IOd以上， 在冷冻下可保存半年；不利于长期保存。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速提取水稻DNA的方法，采用该方法能从 水稻组织中高效、快速、简便的提取模板DNA。为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速提取水稻DNA的方法，包括以下步 骤1)、取0. OOlg 0. Olg水稻样品放入离心管内，然后向离心管内加入500 μ 1试剂 C和200 μ 1氯仿，并加入1 2粒钢珠；试剂C的制作方法如下先由试剂Α、试剂B、蒸馏水按1 2 7的体积比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 1 0. 3%体积比的β -巯基乙醇，得作为DNA提取液的试 剂C;试剂A包括100 200mM sorbitol (山梨醇)、100 150mM Tris (三羟甲基氨基 甲烷)、20 30mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)、400 600mM NaCl,15 25mM Na2S03、 质量浓度0. 8%的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)和质量浓度2%的sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸钠)，其余为蒸馏水；PH7. 5 ；试剂B包括90 IlOmM Tris (三羟甲基氨基甲烧)、450 550mM KC1、15 20mMMgCl2和质量浓度的Triton X_100 (聚乙二醇辛基苯基醚)，其余为蒸馏水；pH9. 0 ；2)、对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；
3)、将步骤2)所得的破碎后的样品进行离心处理；得含DNA的上清液。作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的改进将上述步骤3)所得的含DNA的上 清液继续依次进行以下步骤4)、取步骤3)所得的上清液于另一个离心管内，加1 2体积倍的无水乙醇轻摇 混勻，沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm离心10 15min ；弃上清液，得沉淀；5)、将步骤4)所得的沉淀用体积浓度60 80%的乙醇洗涤，8，000 10，OOOrpm 离心10 15min ；6)、弃步骤5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀为DNA。作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进取步骤3)所得的4 6μ 1 上清液直接作为模板DNA，以试剂D作为PCR反应缓冲液，进行PCR检测；根据PCR检测结 果选择所需的上清液进行步骤4)；试剂D包括40 60mM Tris (三羟甲基氨基甲烧)、200 300mM KCl、8 IOmM MgCl2、质量浓度0.5%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)和体积浓度5 10%的 BSA(牛血清白蛋白)，其余为去离子灭菌水；pH9. 0。作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进步骤2)的破碎为将步骤 1)所得的离心管放入细胞破碎仪内，于28HZ的频率破碎1. 5 2. 5min ；所述步骤3)的离 心为将步骤2)所得的破碎后的样品于8，000 10，OOOrpm离心4 6min。作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进步骤6)为弃步骤5)所得 的上清液，倒置离心管至晾干，附着于离心管壁上的沉淀为DNA。作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进步骤1)中钢珠的粒径为 4 6mm。在本发明中，试剂A、试剂B和试剂D均可利用HCl或NaOH对pH值进行调整。实 际应用时，在使用前，先将试剂A、试剂B、蒸馏水按1 2 7的体积比混合成混合液，然后 再加入占混合液0. 1 0. 3%体积比(优选的0. 2%体积比)的β -巯基乙醇，得作为DNA 提取液的试剂C。试剂A可以破坏水稻组织的细胞壁和细胞膜，试剂B则协调提供一个细胞 裂解、DNA释出的pH环境和离子环境；在使用前才进行试剂C的配制是为了保证试剂A和 试剂B长期存放的稳定性。试剂D则为PCR反应提供稳定的环境和必需的因子。本发明的主要原理为采用试剂A破坏水稻组织的细胞壁和细胞膜，有助于细胞 中DNA的释出，进一步在机械破碎的作用下，使绝大部分的组织细胞破裂，DNA逸出。试剂B 则协调提供一个细胞裂解、DNA释出的pH环境和离子环境，防止释出的DNA发生沉淀或氧 化褐变。当DNA释出于由溶液A和溶液B配制的溶液C中时，通过氯仿的纯化和离心后，获 得的上清液可直接用于PCR反应或通过乙醇沉淀析出DNA用于长期保存或使用。本发明所得的DNA可于_20°C长期保存备用或加100 200 μ 1超纯水溶解用于直 接使用。利用本发明能从水稻组织中高效、快速、简便地提取DNA，可以简化PCR检测技术中提取DNA的耗费人力、物力的繁琐工作。与现有的植物DNA提取方法相比，本发明具有如下优点1)、快速、简便。本发明能够在2min内完成细胞破碎，且一次性可完成48份样品 的破碎。10分钟就可完成96份样品的DNA提取，用于PCR扩增。 而传统的CTAB提取法，完成96份样品的DNA提取则在5小时以上。
2)、成本低。提取过程中减少了多种试剂的使用量，使用本发明从水稻中快速提取 DNA仅应用于PCR反应时，无需使用乙醇或异丙醇沉淀。3)、DNA产量高。0. OOlg的水稻样品用本试剂盒提取，可用作100次PCR扩增的 DNA模板使用。而按照背景技术中告知的《用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法》，以 0. 004g的水稻样品为原料进行提取，所得也无法满足100次PCR扩增的DNA模板所需使用量。4)、周期短。由于所需的水稻样品少，催芽、播种5 8天就可取少量叶片用于PCR 检测。5)、本发明不但可以叶片作为原料，还可以用别的组织(例如根、茎、老叶、嫩叶、 叶鞘、穗等)作为原料；一般来说，根在催芽、播种的5 8天内即能取得。6)、本发明可实现短期使用，也可实现长期保存；具有更大的通用性；具体为利 用本发明所得的DNA溶液可用于短期使用，进一步沉淀获得的DNA与传统方法获得的DNA 是一样的，在冷冻条件下可以保存若干年。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是从水稻叶片中快速提取DNA经PCR扩增后实施的效果图；RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217、RM3183 引物序列来自 GRAMENE 网站 (http://www. gramene. org/)的公开信息，并委托上海申能博彩公司合成用于PCR扩增； Marker为DL2000标准分子量图谱。图2是经沉淀提取的DNA经光密度测定得出的含量对比图，1 5为5份样品的测定值。 图3是来自不同组织样品的模板DNA的PCR扩增产物电泳图。
具体实施例方式实施例1、一种快速提取水稻DNA的方法，依次进行以下步骤1)、取0.005g水稻叶片(日本晴经浸种、催芽后，播种7天后的幼嫩叶片)放入 2ml的圆底离心管(江苏海门耀华玻璃仪器厂生产)，加入500 μ 1试剂C和200 μ 1氯仿， 并加入1粒钢珠(为粒径5mm的碳素钢钢珠，购自上海自行车钢珠厂)；试剂C的制作方法如下先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1 2 7的体积比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 2%体积比的β -巯基乙醇，得试剂C ；该试剂C作为DNA提 取液。试剂A 包括 150mM sorbitol, 125mM Tris,25mM EDTA-Na2,500mM NaCl, 20mMNa2S03，质量浓度0. 8%的CTAB，质量浓度2%的sarkosyl ；其余为蒸馏水；pH7. 5 ；
试剂B 包括 IOOmM Tris,500mM KCl, 18mM MgCl2，质量浓度 1 % 的 Triton X-100， 其余为蒸馏水；PH9. 0 ；2)、将步骤1)所得的离心管放入细胞破碎仪(TiSSueLySerII，QIAGEN，德国)内， 于28HZ的频率破碎2min ；从而实现对水稻叶片进行破碎。3)、将步骤2)所得的破碎后样品于10，OOOrpm离心5min ；得上清液。4)、以2 μ 1的试剂D作为PCR反应缓冲液，取5 μ 1上清液直接作为模板DNA，进行 PCR检测。试剂D 包括 50mM Tris,250mM KCl,9mM MgCl2，质量浓度 0. 5%的 Triton X-100， 体积比10%的BSA(牛血清白蛋白)，其余为去离子灭菌水；pH9.0。该试剂D为10XPCR反 应缓冲液，即试剂D占PCR反应体系的总体积的1/10。用于PCR检测的PCR反应体系具体如下5μ 1 上清液，2μ 1 试剂 D，lunit Taq 酶，200mM dNTP (包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各50mM)，引物浓度0. 2mM,加ddH20补至20 μ L·所用引物分别为以下任意一种RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217 和 RM3183 ；上述引物均可从 gramene 网站 (http //www. Rramene. ors/)上获得。PCR反应过程控制条件如下94 "C 6 分钟94 "C 50 秒55 "C 30 秒72 "C 40 秒 42cycle72 °C 15 分钟15°C 保存所得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图1所示不同的引物均能扩增 出清晰的条带。从而证明步骤3)所得的上清液的确含有足够含量DNA可用于PCR扩增， 并且不同引物均能扩出良好的效果。实施例2、一种快速提取水稻DNA的方法，在实施例1的基础上，根据PCR检测结果 选择所需的上清液继续依次进行以下步骤4)、取400μ 1步骤3)所得的上清液于另一个离心管内，加600 μ 1无水乙醇轻摇 混勻，沉淀45min后，10，OOOrpm离心15min ；弃上清液，得沉淀；5)、将步骤4)所得的沉淀用500 μ 1体积浓度70%的乙醇洗涤，10，OOOrpm离心 15min ；6)、弃步骤5)所得的上清液，倒置离心管至晾干；所得DNA可长期保存。也可将其 加100 μ 1超纯水溶解获得含DNA的溶液。上述6个步骤总计花费在2小时。经测试0. 005克叶片克最终能获得25 μ g左右的核酸。5次重复实验所得的数据 如图2所示。实施例3、分别选用水稻(日本晴)的老叶、茎、鞘、穗、根各0. 005克作为原料替代实施例1中的幼嫩叶片，以RM8213作为引物，其余同实施例1 ；老叶、茎、鞘、穗、根均为90天所得；最 终所得的结果如图3所示。图3证明不同组织所得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果相一致。对比实施例1 选用同实施例1的水稻叶片0. 005g水稻叶片，按照背景技术所告知的DNA快速制 备方法进行提取，所得的上清液再按照上述实施例2的步骤4) 步骤6)进行操作，最终仅 能获得IOyg左右的核酸。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种快速提取水稻DNA的方法，其特征是包括以下步骤1)、取0.001g～0.01g水稻样品放入离心管内，然后向离心管内加入500μl试剂C和200μl氯仿，并加入1～2粒钢珠；试剂C的制作方法如下先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％体积比的β-巯基乙醇，得作为DNA提取液的试剂C；所述试剂A包括100～200mM山梨醇、100～150mM三羟甲基氨基甲烷、20～30mM乙二胺四乙酸二钠、400～600mM NaCl、15～25mM Na2SO3、质量浓度0.8％的十六烷基三甲基溴化铵和质量浓度2％的N-十二烷基肌氨酸钠，其余为蒸馏水；pH7.5；所述试剂B包括90～110mM三羟甲基氨基甲烷、450～550mM KCl、15～20mM MgCl2和质量浓度1％的聚乙二醇辛基苯基醚，其余为蒸馏水；pH9.0；2)、对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；3)、将步骤2)所得的破碎后的样品进行离心处理；得含DNA的上清液。
2.根据权利要求1所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是将上述步骤3)所得的含 DNA的上清液继续依次进行以下步骤4)、取步骤3)所得的上清液于另一个离心管内，加1 2体积倍的无水乙醇轻摇混勻， 沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm离心10 15min ；弃上清液，得沉淀；5)、将步骤4)所得的沉淀用体积浓度60 80%的乙醇洗涤，8，000 10，OOOrpm离心 10 15min ；6)、弃步骤5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀为DNA。
3.根据权利要求1或2所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是取步骤3)所得的 4 6 μ 1上清液直接作为模板DNA，以试剂D作为PCR反应缓冲液，进行PCR检测；根据PCR 检测结果选择所需的上清液进行步骤4)；所述试剂D包括40 60mM三羟甲基氨基甲烧、200 300mM KC1、8 IOmM MgCl2、质 量浓度0. 5%的Triton X-100和体积浓度5 10%的BSA，其余为去离子灭菌水；pH9. 0。
4.根据权利要求3所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步骤2)的破碎为将步骤1)所得的离心管放入细胞破碎仪内，于28HZ的频率破 碎 1. 5 2. 5min ；所述步骤3)的离心为将步骤2)所得的破碎后的样品于8，000 10，OOOrpm离心4 6min。
5.根据权利要求4所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步骤6)为弃步 骤5)所得的上清液，倒置离心管至晾干，附着于离心管壁上的沉淀为DNA。
6.根据权利要求5所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步骤1)中钢珠的 粒径为4 6mm。
全文摘要
本发明公开了一种快速提取水稻DNA的方法，包括以下步骤1)取0.001g～0.01g水稻样品放入离心管内，然后向离心管内加入500μl试剂C和200μl氯仿，并加入1～2粒钢珠；试剂C的制作方法如下先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％体积比的β-巯基乙醇，得作为DNA提取液的试剂C；2)对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；3)将步骤2)所得的破碎后的样品进行离心处理；得含DNA的上清液。采用本发明的方法能从水稻组织中高效、快速、简便的提取模板DNA。
文档编号C12N15/10GK101812446SQ20101015740
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者刘坚, 张光恒, 曾大力, 杨窑龙, 胡江, 郭龙彪, 钱前, 饶玉春, 高振宇 申请人:中国水稻研究所