专利名称：两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用。
背景技术：
麦蚜(尤其是麦长管蚜)是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62%，造成减产15% — 30%，严重时可高达50%。近 年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成2123nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能；Zha等从褐飞虱中肠中克隆了 3个高度表达的基因:N1HT1、Nlcar和Nltry，构建载体，转化水稻，褐飞虱取食转基因水稻后，体内3种基因的mRNA表达水平下降了 40%到70%，并且在水稻的筛管部发现了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等将桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表达)和Rack-1(主要在肠道中表达)2个基因分别导入烟草和拟南芥中，用转基因植物饲喂桃蚜，导致桃蚜体内的MPC002或Rack-1的表达量降低了高达60%，蚜虫的产仔数目减少。小麦抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦抗蚜特性。
发明内容
本发明的一个目的是提供了 dsRNA。本发明提供的dsRNA，为如下1)、2)或3):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA ；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA ；3)由如下两条双链RNA组成:I)所示的双链RNA和2)所示的双链RNA。上述3)所示的dsRNA中，I)所示的双链RNA和2)所示的双链RNA的质量比为1:1。上述1)、2)或3)所示的所述dsRNA的编码基因也是本发明保护的范围，具体如下:1)所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列I所示的核苷酸；2)所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列2所示的核苷酸；3)所示的dsRNA的编码基因具体为由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子组成的组合物。上述dsRNA或上述的编码基因的下述任一种应用也是本发明保护的范围:1)在防治蚜虫中的应用或制备在防治蚜虫产品中的应用；
2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；3)在抑制ill牙虫生长中的应用或制备在抑制ill牙虫生长广品中的应用；4)在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达中的应用或制备在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达产品中的应用。上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长、抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达；所述导入具体为饲喂； 所述蚜虫具体为麦长管蚜。含有上述dsRNA的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒的下述任一种应用也是本发明保护的范围:1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；4)在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达中的应用或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达产品中的应用。所述蚜虫具体为麦长管蚜。本发明的另一个目的是提供产品，其活性成分为如下A-C中至少一种:A、上述 dsRNA;B、上述的编码基因；C、上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒；所述产品为如下I)-4)中任意一种:1)防治蚜虫产品；2)促进蚜虫死亡产品；3)抑制蚜虫生长产品；4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表达产品；所述蚜虫具体为麦长管蚜。抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表达的物质的下述任一种应用也是本发明保护的范围:I)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；所述蚜虫具体为麦长管蚜。上述生长发育相关基因23028的核苷酸序列为序列表中的序列I ;上述唾液分泌蛋白基因coo2的核苷酸序列为序列表中的序列7。本发明中抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表达的物质为上述A-C中的任意一种。本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜相关基因23028和coo2表达cDNA的序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内生长发育相关基因23028和coo2表达，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着dsRNA浓度增大和饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增大。表明蚜虫生长发育相关基因23028和coo2的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。
图1为基因23028、coo2和GFP的PCR扩增图2为饲喂8天后麦长管蚜的生长发育情况
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中麦长管蚜(钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦长管蚜有性世代的研究.植物保护，1982，01，14-15.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中(温度(20±2) °C，湿度60% — 80%，光周期L: D=16: 8)进行繁殖。质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamH 1、EcoR V及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5 α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaqDNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel ExtractionKit、RNA Cleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。实施例1、麦长管蚜相关基因23028dsRNA和coo2dsRNA的获得1、麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成分别取约20头麦 长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA,用RNA Cleaning Kit进行纯化,反转录合成cDNA第一链,操作步骤均参考试剂盒说明书。2、引物设计与基因克隆
根据本实验室对于麦长管蚜转录组测序的结果得到生长发育相关基因23028 (序列I)和根据桃蚜唾液分泌蛋白coo2 (序列7)的序列，用DNAman5.0进行比对，选择保守序列，利用Primer Primer5.0软件设计引物Pl和P2(表1)，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段从国家小麦改良中心实验室保存的GFP质粒上扩增，利用PrimerPrimer5.0软件设计引物P3 (表I)。PCR 反应体系为 10XPCR Buffer5 μ L, dNTP (2.5mmol.L-1) 4 μ L、rTaq0.5 μ L，Forward primer (20 μ mol.L-1) I μ L> Reverse primer (20 μ mol.L-1) I μ L> cDNA/GFP M粒 I μ L，用 ddH20补足至 50 μ L。PCR 的反应条件为 94。。4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s,39 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。以麦长管蚜的cDNA为模板，用Pl作为引物进行扩增，得到238bp PCR产物(基因23028序列上部分片段，含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该238bp PCR产物具有序列表中的序列I (可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列I所示的核苷酸编码66个氨基酸。以麦长管蚜的cDNA为模板，用P2作为引物进行扩增，得到307bp PCR产物(基因coo2序列上部分片段，含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该307bp PCR产物具有序列表中的序列2 (可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列2所示的核苷酸编码89个氨基酸。以GFP质粒为模板，用P3作为引物进行扩增，得到324bp PCR产物(含40bp的T7启动子序列)，其具有序列表中的序列3 (可人工合成)所示的核苷酸。将上述PCR 电泳结果如图1 所示，M:Trans2K DNA marker ；1:23028 基因；2:coo2基因；3:GFP，可以看出得到目的片段。
表I为PCR扩增引物
权利要求
1.sRNA，为如下 1),2)或 3): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA； 3)由如下两条双链RNA组成:I)所示的双链RNA和2)所示的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的dsRNA，其特征在于:所述3)所示的dsRNA中，I)所示的双链RNA和2)所示的双链RNA的质量比为1:1。
3.权利要求1中1)、2)或3)所示的dsRNA的编码基因； 1)所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列I所示的核苷酸； 2)所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列2所示的核苷酸； 3)所示的dsRNA的编码基因具体为由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子组成的组合物。
4.权利要求1或2所述dsRNA或权利要求3所述的编码基因的下述任一种应用: 1)在防治蚜虫中的应用或制备在防治蚜虫产品中的应用； 2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用； 3)在抑制Φ牙虫生长中的应用或制备在抑制Φ牙虫生长广品中的应用； 4)在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达中的应用或制备在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述应用为将权利要求1或2所述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长、抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述导入为饲喂。
7.有权利要求1或2所述的dsRNA的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒。
8.权利要求7重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒的下述任一种应用:: 1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用； 2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用； 3)在抑制Φ牙虫生长中的应用或在制备抑制Φ牙虫生长广品中的应用； 4)在抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达中的应用或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表达产品中的应用。
9.品，其活性成分为如下A-C中至少一种: A、权利要求1或2所述dsRNA； B、权利要求3所述的编码 基因； C、权利要求7所述的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒； 所述产品为如下I)-4)中任意一种:1)防治蚜虫产品；2)促进蚜虫死亡产品；3)抑制蚜虫生长产品；4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表达产品。
10.制蚜虫体内生长发育相关基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表达的物质的下述任一种应用: 1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用； 2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用； 3)在抑制蚜虫生长中的应用 或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用。本发明提供的dsRNA，为如下1)、2)或3)1)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；3)由如下两条双链RNA组成1)所示的双链RNA和2)所示的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜体内生长发育相关基因23028和唾液分泌蛋白基因coo2的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内生长发育相关基因23028和唾液分泌蛋白基因coo2，导致麦长管蚜生长发育受阻并产生致死效应。
文档编号C12N15/63GK103088024SQ20131000720
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月9日 优先权日2013年1月9日
发明者夏兰琴, 张珉, 李雪峰 申请人:中国农业科学院作物科学研究所