专利名称：一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法，属于DNA测序领域。
背景技术：
表观遗传学作为遗传学的一门重要分支学科，主要研究基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，其主要内容包括DNA甲基化、基因组印记、RNA干扰和组织蛋白修饰等。 近几年来，越来越多的人开始关注DNA甲基化，相关的研究更是如火如荼的开展起来。DNA 甲基化是最早发现的修饰途径之一，其存在与基因的沉默与表达有着密切的联系。通常在甲基化转移酶的作用下甲基化发生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，接着TET 家族酶处理后，5mC转化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC可以进一步氧化成5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，5caC被TDG酶切除，最后通过碱基缺失修复还原成胞嘧啶，这是一个完整的去甲基化过程。这些年来，5 mC得到广泛的研究，作为一种稳定且重要的表遗传修饰，参与基因表达调控、X-染色体失活、基因组印记、转座子的长期沉默和癌症的发生，被称为基因组第五碱基；而5hmC的存在，近年来应用了高精确的质谱分析和高通量测序方法，发现5hmC的形成与恶性血液肿瘤相关；最新报导5fC的存在与RNA的转录酶 II的转录速率和底物特异性有着十分重要的联系。关于DNA甲基化检测的文章已经报导了很多，而作为2011年刚被发现的5fC却很少得到检测。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。
本发明提供的技术方案是一种DNA中5-醛基胞嘧啶的检测方法，具体为向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5°/Γ20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数；一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法，具体步骤为O向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5°/Γ20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数；2)将带荧光标记的DNA加入到高 钌酸钾存在的氢氧化钠的水溶液中反应，分离出带荧光标记的DNA，然后加入哌啶的水溶液，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶位置和个数，与步骤I)中检测到的5-醛基胞嘧啶的位置和个数进行比较得到DNA中5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
哌啶特异性的与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应，而经高钌酸钾氧化后的 5_羟甲基胞嘧啶转化为5-醛基胞嘧啶，也可以与哌啶反应。通过比较变性胶中两个反应的 DNA带可以清楚的看到5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
本发明是通过哌啶与DNA中5-醛基胞嘧啶特异性的反应，经过哌啶的热处理会使 DNA中5-醛基胞嘧啶的位置特异性的断裂，从而会在20%的DNA聚丙烯酰胺变性胶上看到特异性的DNA断裂带，从而确定DNA中5-醛基胞嘧啶在DNA序列中的位置。而对于含有 5-羟甲基胞嘧啶的DNA，它会被高钌酸钾(KRuO4)氧化成5-醛基胞嘧啶的DNA，同样经过哌啶处理后会在变性胶上显示出5-醛基胞嘧啶的位置。通过比较两条胶带可以看出经氧化剂氧化后新生成的DNA断裂带就是5-羟甲基胞嘧啶的位置。
本方法可以实现快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
图1为实施例f 4的变性胶图结果比较，图中的泳道I代表实施例4中的对照实验的结果，2飞依次代表实施例Γ4的结果。
图2为实施例5中步骤I)和步骤2)的照胶结果，其中，代表步骤I)没有经过KRuO4处理直接哌啶处理，“ + ”代表步骤2)经过KRuO4处理后哌啶处理，图中的1234分别代表不同的DNA序列，其中，I代表只含有一个羟甲基胞嘧啶的DNA序列，2代表只含有一个甲基胞嘧啶的DNA序列，3代表只含有一个醛基胞嘧啶的DNA序列，4代表同时含有这三种特殊胞嘧啶的DNA序列；XYZ分别表示序列中的不同的位置。
具体实施方式
以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1 :5_醛基胞嘧啶DNA与5%哌啶的反应取5-醛基胞嘧啶DNA (10 μΜ)2 μ L加入93 μ L的水和5 μ L的哌啶，90°C热处理O.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有10%的5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
实施例2 :5-醛基胞嘧啶DNA与10%哌啶的反应取5-醛基胞嘧啶DNA (10 μΜ)2 μ L加入88 μ L的水和10 μ L的哌啶，90°C热处理O. 5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有35%的5-醛基胞嘧啶DNA 发生断裂。
实施例3 :5_醛基胞嘧啶DNA与15%哌啶的反应取5-醛基胞嘧啶DNA (10 μΜ)2 μ L加入83 μ L的水和15 μ L的哌啶，90°C热处理O. 5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有50%的5-醛基胞嘧啶DNA 发生断裂。
实施例4 :5-醛基胞嘧啶DNA与20%哌啶的反应取5-醛基胞嘧啶DNA (10 μΜ)2 μ L加入78 μ L的水和20 μ L的哌啶，90°C热处理O. 5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有50%的5-醛基胞嘧啶DNA 发生断裂。
作为对照，取5-醛 基胞嘧啶DNA (10 μ M) 2 μ L加入98 μ L的水，直接90°C热处理O. 5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，无5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
比较实施例f 4的照胶结果，可以看出，5-醛基胞嘧啶DNA直接热处理是无法观察到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数的，经过哌啶处理后，可以清楚的看到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数，如图1所示，说明该方法快速、灵敏且有效。
实施例5 :5-轻甲基胞嘧啶的检测 O带有不同胞嘧啶的DNA与哌啶的反应取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列I (10 μ M) 2 μ L加入83 μ L的水和15 μ L的哌啶， 90°〇热处理0.5 h后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，没有5-羟甲基胞嘧啶 DNA发生断裂。
取5-甲基胞嘧啶DNA序列2(10 μ Μ)2 μ L，处理方法同上，也没有出现5_甲基胞嘧啶DNA断裂。
取5-醛基胞嘧啶DNA序列3 (10 μ M) 2 μ L，处理方法同上。有50%的5_醛基 DNA发生了断裂。
取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4 (10 μΜ)2 μ L，处理方法同上。只有5-醛基胞嘧啶的位置发生了断裂。
2)带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO4氧化然后与哌啶的反应取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列I (10 μΜ) 2 μ L加入NaOH溶液(50 mM) 19 μ L和 KRuO4 (1. 5mM) 4 μ L，4°C反应Ih后，除去KRuO4.再加入85 μ L的水和15 “1^的哌啶901 热处理O. 5 h后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有51% 5-醛基胞嘧啶DNA 发生断裂。
取5-甲基胞嘧啶DNA序列2 (10 μ M) 2 μ L，处理方法同上。
取5-醛基胞嘧啶DNA序列3 (10 μ Μ) 2 μ L，处理方法同上。
取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4 (10 μΜ) 2 μ L，处理方法同上。
通过比较实施例5中步骤I)和步骤2)的照胶结果，可以看出，带有不同胞嘧啶的 DNA直接与哌啶反应DNA序列I在X和Z的位置都是胞嘧啶，在Y的位置是5hmC ；DNA序列2在X和Z的位置都是胞嘧啶，在Y的位置是5mC ；DNA序列3在X和Z的位置是胞嘧啶， 在Y位置是一个5fC ；DNA序列4在X的位置是胞嘧啶，Y位置是5hmC，Z位置是5fC，从电泳图的结果可以清晰的看出5fC存在于DNA序列3和DNA序列4中，如图2所示。而带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO4氧化然后与哌啶反应DNA序列I在X和Z的位置是胞嘧啶，Y 位置是一个5hmC，；DNA序列2在X和Z的位置是胞嘧啶，Y位置是5mC ；DNA序列 3在X和 Z的位置是胞嘧啶，Y位置5fC ； DNA序列4在X的位置是胞嘧啶，Y位置是5hmC，Z位置是 5fC,如图2所示。对比图2左右两个图可以看到DNA序列I和DNA序列4在右图中出现了两条新的断裂带，此新增的断裂带刚好是预期的5hmC的位置。通过此种方法，我们可以达到分别检测5fC和5hmC的目标。
本实施例步骤2)中的哌啶水溶液的体积浓度替换为5°/Γ20%中的任意浓度不影响本实施例的效果。
权利要求
1.一种DNA中5-醛基胞嘧啶的检测方法，其特征在于，具体为向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5°/Γ20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数。
2.—种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法，其特征在于，具体步骤为O向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5°/Γ20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数；2)将带荧光标记的DNA加入到高钌酸钾存在的氢氧化钠的水溶液中反应，分离出带荧光标记的DNA，然后加入哌啶的水溶液，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶位置和个数，与步骤I)中检测到的5-醛基胞嘧啶的位置和个数进行比较得到DNA中5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
全文摘要
本发明公开了一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。用哌啶特异性地与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应，可以检测出5-醛基胞嘧啶；而通过高钌酸钾将DNA中的5-羟甲基胞嘧啶氧化成5-醛基胞嘧啶后哌啶处理，通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带可以得到5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。本方法可以快速、有效和灵敏地实现5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的检测。
文档编号C12Q1/68GK103060450SQ20131000748
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月9日 优先权日2013年1月9日
发明者周翔, 毛伍祥, 郭枫晚 申请人:武汉大学