本发明涉及有机酸领域，具体为一种从发酵液中高效地提取利用发酵生产的有机酸的方法。
背景技术：
目前有机酸、如乳酸、琥珀酸等被用于医药、农药、化妆品等各种用途。作为有机酸的制造方法，自古以来使用发酵法。一般而言，由于有机酸生产菌生产的有机酸导致发酵抑制，大多在发酵液中加入碱一边调整至pH中性附近一边进行发酵。在该情况下，将有机酸作为pH调整剂的盐进行回收。例如，乳酸可作为乳酸铵，利用无机酸和烷基胺进行提取。但是，由于这样的pH调整操作繁杂，还需要从有机酸盐回到有机酸的工序，因而制造成本高。因此，提出了使用将可在酸性条件下进行发酵的、赋予了耐酸性的菌，如耐酸性微生物作为宿主的转化体来进行发酵。在该情况下，可将有机酸以酸的形态进行回收。作为该回收方法，已知例如用非水溶性胺与非水溶性有机酸的混合物进行提取的方法，用含氧饱和杂环式化合物进行提取的方法，用与水共沸的溶剂进行提取的方法。在第1种方法中，为了将提取和反提取设为相同温度，需要使用非水溶性有机酸。而且，由于必须限定该有机酸和胺的混合比例的范围，且该范围必须根据所制造的有机酸进行变更，因此不实际。第2种方法中，作为含氧饱和杂环式化合物可使用四氢呋喃等，但这样的亲水性溶剂也会提取发酵液中所含的有机酸以外的亲水性物质。在第3 种方法中，作为与水共沸的溶剂，例如可使用甲醇、乙醇等低级醇，但在纯化工序中必须大量去除这些提取用醇，并且还存在酯化的问题。
技术实现要素：
针对上述现有技术的缺点，本发明提供一种在发酵工序中无需耗费pH调整的工时、不存在上述各种问题、可以高效地回收作为目的物的有机酸的有机酸的制造方法。
本发明解决上述技术问题采用以下技术方案：一种从发酵液中提取有机酸的方法，包括通过发酵生产有机酸，得到pH为1～5的含有机酸粗液的第1工序；和用含酯化合物的提取介质从所述第1工序所得到的含有机酸粗液中提取该有机酸，得到含有所述有机酸的提取液的第2工序。
作为优选，所述酯化合物为碳数10～30的二酯化合物。
作为优选，所述二酯化合物为脂肪族二羧酸的二烷基酯。
作为优选，所述二酯化合物为选自富马酸双(2-乙基己基)酯、癸二酸双(2-乙基己基)酯、衣康酸双(2-乙基己基)酯、壬二酸双(2-乙基己基)酯、以及马来酸双(2-乙基己基)酯的二酯化合物。
作为优选，所述提取介质还含有烷基胺化合物。
作为优选，所述烷基胺化合物为碳数15～39的三烷基胺。
作为优选，所述三烷基胺为选自三己基胺、三辛基胺、三癸基胺。
作为优选，所述提取介质中的烷基胺化合物/酯化合物的体积比为0.6/1～9/1。
作为优选，还包括使用水从所述提取液提取所述有机酸，得到含有所述有机酸的提取液的第3工序。
作为优选，所述第3工序在60～90℃下进行。
本发明与现有技术相比具有如下优点：如果采用本发明的制造方法，则不需要在发酵工序中进行pH调整。此外，通过酯化合物和烷基胺化合物的组合，可选择性地、高效地得到有机酸。即，可几乎不提取发酵液中的成分(尤其是葡萄糖)地以简便的操作选择性地得到有机酸。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明中，有机酸只要是具有羧基的有机化合物即可，例如可例举乳酸、3-羟基丙酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、马来酸、戊二酸、以及己二酸等。其中，从具有广泛用途的方面考虑，优选乳酸。这些有机酸可以是D构型、L构型、DL构型的任一种，此外，也可以形成为低聚物，即聚合度2～ 15左右的聚合物。
第1工序的发酵如果是利用微生物来生产有机酸，则可以是只生产该有机酸的同型发酵，也可以是在该有机酸以外还生产乙醇等的异型发酵。微生物可以是野生型以及转基因型的任一种。作为野生型微生物，例如可例举链球菌属、片球菌属、明串珠菌属、以及乳杆菌属等乳酸发酵菌；厌氧螺菌属、以及棒杆菌属等琥珀酸发酵菌。
作为转基因型微生物，可例举转基因乳酸生产酵母，例如将粟酒裂殖酵母作为宿主，整合入乳酸脱氢酶基因，并使该宿主的编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体，将酵母属的酵母等耐酸性微生物作为宿主，在该耐酸性微生物内导入了编码乳酸脱氢酶的基因的转化体，以及导入了编码乳酸脱氢酶的基因，并使编码丙酮酸脱羧酶1的基因缺失或失活了的酿酒酵母等。其中，从可不需要将pH调整至中性附近、能够以高生产性生产乳酸的方面考虑，优选将粟酒裂殖酵母作为宿主，整合入乳酸脱氢酶基因，并使该宿主的编码丙酮酸脱羧酶的基因簇部分缺失或失活的转化体。对发酵所使用的发酵液没有特别限定，只要含有适合目的有机酸的生产的Na、K等基本无机盐类以及碳源即可。此外，根据需要也可以含有氮源以及氨基酸等成分。发酵液可以是天然、合成或半合成发酵液的任一种。作为碳源，例如可例举葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖。作为氮源，例如可例举氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、胨、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物等。作为无机盐类，例如可例举磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾等。另外，可掺合蛋白脂质等发酵促进因子等。
作为糖，优选使用葡萄糖。发酵初期的发酵液(100质量％)中的葡萄糖浓度优选为1质量％以上，更优选1～25质量％，进一步优选2～16质量％。由于发酵导致葡萄糖浓度下降，优选根据需要添加葡萄糖来继续发酵。发酵末期的葡萄糖浓度可以在1质量％以下。此外，在一边分离有机酸一边使发酵液循环进行连续发酵的情况下，优选维持上述葡萄糖浓度。通过将葡萄糖浓度设为2质量％以上，可提高有机酸的生产性。此外，通过将发酵液中的葡萄糖设为16质量％以下，可进一步提高有机酸的生产效率。
此外，为了提高生产性，优选进行高密度发酵。高密度发酵中，发酵液中的转化体的初始菌体浓度以干燥菌体重量换算值表示优选设为0.1 ～ 50g/L，更优选设为0.2 ～40g/L。通过提高初始菌体浓度可以在短时间内实现高生产性。此外，如果初始菌体浓度过高则有可能产生菌体的凝集和纯化效率的降低等问题。另外，后述的实施例等示出的菌体浓度是由通过日本分光株式会社制可视紫外分光器V550测定的波长660nm的光的吸光度(OD660)换算的值。660nm 中的OD ＝1，相当于酵母干燥重量的0.2g/L、湿重量的0.8g/L。
发酵可以采用公知的发酵方法，例如可以通过循环发酵、搅拌发酵等进行。发酵温度优选23～37℃。此外，发酵时间可适当决定。发酵可以是分批发酵，也可以是连续发酵。例如，可在以分批发酵进行发酵后，将菌体从发酵液中分离，取得含有有机酸的发酵液。此外，连续发酵法中，例如可例举重复以下操作来连续地进行发酵的方法；该操作是：从发酵中的发酵槽取出部分发酵液，在从取出的发酵液中分离有机酸的同时，将在分离了有机酸后剩下的发酵液中加入葡萄糖和新的发酵液并返回发酵槽。通过进行连续发酵，可进一步提高有机酸的生产性。
所生产的含有有机酸的含有机酸粗液的pH 为1 ～ 5，优选1.5 ～ 4，特别优选1.5 ～ 3.5。本发明的有机酸的制造方法中，优选采用即使有机酸向发酵液的积聚导致pH变低，也可不进行pH 调整而生产有机酸的发酵法。即，优选采用即使在发酵液的pH 变低之后，也可以通过直接继续发酵的连续发酵来制造有机酸的发酵法。在该发酵法中，为了提高有机酸的生产性，优选即使在发酵液的pH 为3.5 以下之后，也进一步继续发酵。尤其，由于上述粟酒裂殖酵母的转化体的耐酸性优良，可不调整所生产的含有有机酸的发酵液的pH而继续发酵。
第2 工序中，用含酯化合物的提取介质从第1 工序所得到的含有有机酸的含有机酸粗液提取目的有机酸，得到提取液(1)。该含有机酸粗液可直接用于提取，但优选在提取之前通过离心分离或者过滤等菌体分离处理将菌体分离。作为离心分离的条件的例子，可例举1000 ～ 5000G 中，10 ～ 15 分钟。此外，作为过滤的条件，可例举使用标称筛孔径0.1 ～2μm 的过滤膜。作为含有机酸粗液的典型组成，例如含有有机酸50 ～ 120g/L、糖0.5 ～20g/L、乙醇1 ～ 20g/L。作为酯化合物，优选选自碳数4 ～ 40 的脂肪族酯以及芳香族酯的至少一种。如果是碳数在上述范围内的酯化合物，则由于具备适当的极性和沸点，因此容易高效地进行提取，并且容易在其后的工序中被除去。作为该酯化合物的常压下的沸点，优选为250℃以上。该沸点的上限没有特别限定，通常而言为400℃以下。但是，在不存在常压下的沸点而仅存在分解点的情况下，分解点优选为250℃以上。
作为本发明中的酯化合物，在上述脂肪族酯和芳香族酯中，优选脂肪族酯。即，优选为酯化合物中的羧酸残基和醇残基的任一种脂肪族化合物的残基。
酯化合物根据1 个分子中的酯基数量，分为单酯化合物和聚酯化合物。作为本发明中的酯化合物，优选酯基数量为2 ～ 4 的聚酯化合物，更优选二酯化合物。特别优选碳数10 ～ 30 的脂肪族二酯化合物。
作为二酯化合物，可例举具有1 个二羧酸残基和2 个一元醇残基的二酯化合物、具有2 个单羧酸残基和1 个二元醇残基的二酯化合物等。作为本发明中的酯化合物，可以是这些二酯化合物中的任一种，更优选具有二羧酸残基和一元醇残基的脂肪族的二酯化合物。特别优选具有饱和或不饱和脂肪族二羧酸残基和烷醇残基的二酯化合物。
本发明中的优选酯化合物为碳数10 ～ 30 的脂肪族二酯化合物，其中更优选具有饱和或不饱和脂肪族二羧酸残基和烷醇残基( 即，烷基) 的脂肪族二酯化合物。此外，饱和脂肪族二羧酸残基的碳数( 包括羰基的碳原子的数) 优选为5 ～ 15，更优选6 ～ 12。不饱和脂肪族二羧酸残基的碳数( 包括羰基的碳原子的数) 优选为4 ～ 8，更优选4 ～ 6。烷醇残基(即，烷基) 的碳数优选2 ～ 12，更优选6 ～ 10。
具体而言，例如可例举己二酸二乙酯、己二酸二异壬酯、己二酸二异十一烷酯、己二酸双(2- 乙基己基)酯、庚二酸二乙酯、庚二酸二癸酯、癸二酸二辛酯、癸二酸双(2- 乙基己基) 酯、癸二酸二丁酯、壬二酸二乙酯、壬二酸二辛酯、壬二酸双(2- 乙基己基)酯、壬二酸二己酯、十二烷二酸双(2- 乙基己基)酯、富马酸二丁酯、富马酸二壬酯、富马酸双(2- 乙基己基) 酯、马来酸二己酯、马来酸双(2- 乙基己基) 酯、衣康酸二丙酯以及衣康酸双(2- 乙基己基)酯。
其中，最优选选自富马酸双(2- 乙基己基) 酯、癸二酸双(2- 乙基己基) 酯、衣康酸双(2- 乙基己基) 酯、壬二酸双(2- 乙基己基) 酯、以及马来酸双(2- 乙基己基) 酯的酯化合物。
上述提取介质进一步优选含有烷基胺化合物。作为烷基胺化合物，优选二烷基胺化合物或三烷基胺化合物。作为二烷基胺化合物，优选具有2 个碳数3 ～ 15 的烷基的化合物。作为三烷基胺化合物，优选具有3 个碳数3 ～ 15 的烷基的化合物。二烷基胺化合物或三烷基胺化合物的1 分子中的的多个烷基可以不同。
如果是上述烷基胺化合物，则与上述酯化合物的相溶性良好，可提高该酯化合物对目的物有机酸的提取效率。此外，在进一步进行后述的通过水的提取的情况下，也不妨碍将该有机酸提取到水中。
作为该烷基胺的常压下的沸点，优选为250℃以上。该沸点的上限没有特别限定，通常而言为400℃以下。但是，在不存在常压下的沸点而仅存在分解点的情况下，分解点优选为250℃以上。
更优选使用碳数15 ～ 39 的三烷基胺。例如可例举二丁基十一烷基胺、三戊基胺、二戊基十一烷基胺、三己基胺、三辛基胺、三壬基胺、三( 十一烷基) 胺、三癸基胺、以及三(十二烷基) 胺。其中最优选选自三己基胺、三辛基胺、三癸基胺、以及三( 十二烷基)胺的烷基胺化合物。
在并用酯化合物和烷基胺化合物的情况下，它们的比例以烷基胺化合物/ 酯化合物的体积比计，优选0.6/1 ～ 9/1，更优选1/1 ～ 3/1。如果在该范围内，则可提高提取效率。
提取如下进行：将含有机酸粗液和提取介质在优选0 ～ 40℃、更优选0 ～ 30℃的温度下进行混合、接触。含有机酸粗液/ 提取介质的体积比为0.5/1 ～ 2/1，优选设为0.8/1 ～ 1.2/1。提取时间根据混合、接触效率而定，但通常可为1 分钟～ 10 分钟。
提取可以通过分批操作进行，也可以通过连续操作进行。从提取效率高、容易将操作所需要的能量抑制在低水平的方面考虑，优选连续操作。作为分批操作，可例举振荡操作、搅拌操作等。作为连续操作，可使用板式塔或填充塔等塔进行并流提取或者逆流提取。从提高提取效率、容易将装置小型化的方面考虑，优选使用填充塔进行逆流提取。
由该提取介质进行的提取中的分配系数根据作为对象的有机酸以及提取介质而定，但优选0.2 以上，更优选0.3 以上。此外，提取率优选20％以上，更优选25％以上。
作为提取介质，在并用酯化合物和烷基胺化合物的情况下，由该提取介质进行的提取中的分配系数优选1.0 以上，更优选1.4 以上。此外，提取率优选50％以上，更优选60％以上。
另一方面，发酵培养基所含的碳源( 例如葡萄糖)、发酵中生产的有机物( 例如乙醇)的提取率优选20％以下，更优选15％以下，进一步优选10％以下，特别优选5％以下。
提取液(1) 可通过减压蒸留等除去提取介质，得到有机酸。优选在第3 工序中使用水从提取液(1) 中提取该有机酸，得到含有有机酸的提取液(2)。从容易提高最终得到的有机酸的纯度的方面考虑，优选水中不含有盐类。即，作为水可以是离子交换水、蒸馏水、纯水等的任一种。由水进行的提取优选在60 ～ 90℃，更优选70 ～ 90℃下进行。在提取液(1)/ 水的体积比为0.5/1 ～ 2/1，优选0.8/1 ～ 1.2/1 的条件下进行提取。提取时间根据混合、接触效率而定，但通常可为3 小时～ 6 小时。
作为提取介质，在并用酯化合物和烷基胺化合物的情况下，由水进行的提取中的分配系数优选1.0 以上，更优选1.4 以上。此外，提取率优选50％以上，更优选60％以上。
优选第3 工序与第2 工序连续进行，但也可以是分批式进行。可以通过对第3 工序所得到的提取液(2) 以减压蒸馏等除去水，得到有机酸。此时，可以对提取液(2)使用公知的方法例如活性碳处理等进行纯化。
下面示出实施例，对本发明进行详细说明。但是，本发明并不局限于这些实施例。
含乳酸粗液的制备：使用现有技术制作的转基因乳酸生产酵母ASP2782(将粟酒裂殖酵母作为宿主，整合入乳酸脱氢酶基因，并使该宿主的编码丙酮酸脱羧酶的基因pdc-2缺失的转化体) 进行乳酸发酵。在D12 液体培养基( 葡萄糖12％ )上接种该转化体，在温度32℃、振荡速度100rpm 的条件下使其发酵20 小时，可得到乳酸浓度85.7g/L 的发酵液(pH2.3)。对该发酵液实施离心分离(12000G，5 分钟)，得到作为含乳酸粗液的上清液。
实施例1～6
提取液(1)：将得到的含乳酸粗液和酯化合物以体积比1：1 进行混合。将得到的混合液在25℃下保持15 分钟后振荡1 分钟，以离心分离(3000G，5分钟) 分开有机相和水相。除去水相，得到提取液(1)。对该提取液(1) 中的乳酸浓度通过高效液相色谱分析(HPLC)法制；柱：东曹株式会社制，进行测定，求出提取率和提取分配系数。此外，在实施例1 中，同样通过HPLC 法求出的葡萄糖、以及乙醇的提取率分别为2.3％和14.8％。
提取液(2)：在提取液(1) 中添加与该提取液(1) 相同体积的离子交换水，在80℃下搅拌5 小时后，以离心分离分开有机相和水相。除去有机相，得到提取液(2)。通过HPLC 法测定该提取液(2) 中的乳酸浓度，求出提取率和提取分配系数。
实施例7 ～ 12
提取液(1)：将得到的含乳酸粗液、酯化合物、和三正辛胺以体积比5 ∶ 2 ∶ 3 进行混合。将得到的混合液在25℃下保持15 分钟后振荡1 分钟，以离心分离(3000G，5 分钟)分开有机相和水相。除去水相，得到提取液(1)。通过HPLC 法测定该提取液(1) 中的乳酸浓度，求出提取率和提取分配系数。此外，在实施例7 中，同样通过HPLC 法求出的葡萄糖、以及乙醇的提取率分别为3％和5％。
提取液(2)：在提取液(1) 中添加与该提取液(1) 相同体积的离子交换水，在80℃下搅拌5 小时后，以离心分离分开有机相和水相。除去有机相，得到提取液(2)。通过HPLC 法测定该提取液(2)中的乳酸浓度，求出提取率和提取分配系数。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。