甾醇类化合物的方法，它的步骤如下：
[0024] (1)降留醇微生物的分离：烟叶来源于河南襄县，将烟叶去梗后，叶片剪成 2cm*2cm的小叶片，用无菌去离子水洗涤2次，收集沉淀，用15mlpH7. 0的磷酸缓冲液稀释 沉淀，按照10%接种量接种到分离培养基中，37°C摇床中，150r/min培养，富集培养2次后， 取200μ1培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解留醇的微生物单菌落。所述分离 培养基的原料为：豆留醇7412.lg;失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（tWeen80)0. 9ml;柠檬 酸 2.lg;Κ2ΗΡ040· 4g;NH4C1 1.lg;加水到 0· 9L。
[0025] (2)微生物扩大培养：挑取步骤（1)中的单菌落到种子培养基中，于37°C摇床中， 150以11^11培养48小时，获得种子培养液，保存于4°(：，同时取0.51111菌液加0.51111的50%甘 油混匀后保存于_20°C。所述种子培养基的成分为：K2HP040 . 6g、NH4N032.lg、柠檬酸1. 9g、 甘油 9. 9g、加水到 1. 1L，pH= 7· 0-7. 2。
[0026] (3)以步骤⑵中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养 基中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定0D值，绘制细胞生长曲线，见图 1。在不同的生长阶段（初期（18h)、对数期（36h)以及后期（52h))收集细胞，分别在6000 转，4°C下离心30min，去掉上清液。
[0027] (4)微生物降解留醇条件优化：利用正交实验设置3个不同培养温度：30°C、37°C、 42°C;3个不同的pH值：5. 0,6. 0, 7. 0。结合微生物的生长曲线，收集不同生长阶段的细胞 (初期（18h)、对数期（36h)以及后期（52h))，并以质量1 :50的比例将干细胞加入到烟草 浸提液中，置于37°C的摇床中，150r/min下发酵4h，采用液相质谱法测定发酵前后的甾醇 含量（标准YC/T501-2014)。确定微生物的最优降解条件（表1)。其特点在于：根据微生 物的生长曲线，设定了 9组正交实验，并以特定的细胞干重比例（1 :50)加入到烟草浸提液 中，最终确定了最优条件为pH5,温度37°C下的对数期细胞降解效率最高。
[0028] 表1不同条件下甾醇的降解率
[0029]
[0030] (5)不同甾醇的降解率：利用液相质谱法（标准YC/T501-2014)测定烟草浸提液 中的留醇，并确定5种不同留醇在发酵前后的含量，通过计算确定最终的降解效率。图2和 图3为标准溶液和烟草浸提液中的留醇液相质谱图。
[0031] 甾醇含量以每ml体积中的μg为计量单位，其甾醇降解率计算公式如下：
[0032]
【主权项】
1. 一种生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法，其特征在于：通过培养基从烟 草表面分离留醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草 浸提液，发酵。2. 如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法，其特征在于， 它的步骤如下： (1) 降留醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2-3次，收集沉淀，将沉淀用15ml pH7. 0的磷酸缓冲液稀释后，按照10%接种量接种到分离培养基中，37°C摇床中，150r/min 培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μ1培养液涂于固体平板上，培养48h后获得 可降解留醇的微生物单菌落； (2) 微生物扩大培养：挑取步骤（1)中的单菌落到种子培养基中，于37°C摇床中，150r/ min培养48小时，获得种子培养液，保存于4°C，同时取0. 5ml菌液加0. 5ml的50%甘油混 匀后保存于_20°C; (3) 以步骤⑵中的种子培养液为种子，重新取lml接种到50ml新鲜的种子培养液中， 相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18-52h收集细胞，分别在 6000转，4°C下离心30min，去掉上清液； ⑷甾醇降解条件：收集18_52h的细胞，并以质量1 :50的比例将干细胞加入到烟草浸 提液中，置于37°C的摇床中，150r/min下发酵2-8h。3. 如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法，其特征在 于：所述步骤（1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆留醇2. 0±0.lg; 葡萄糖2.0±0.lg;失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.lml;柠檬酸2.0±0.lg; Κ2ΗΡ040· 5±0·Olg;NH4C1L0±0·lg;余量为水。4. 如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法，其特征在 于：所述步骤（1)中富集培养基的组分：以富集培养基总量1L计，豆留醇，5. 0±0.1g; 七界661180，1±0.11111;柠檬酸，2.0±0.18;柠檬酸铁胺，0.05±0.018 ;1(2即04,0.5±0.18; NH4C1，1.0±0.lg;余量为水。5. 如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法，其特征在 于：所述步骤⑶中的种子培养液的组分：以种子培养液总量1L计，K2HP04,0. 5±0.Olg; ΝΗ4Ν03,2·0±0·lg;柠檬酸，2·0±0·lg;甘油，10.0±0.2g;余量为水，pH= 7.0-7.2。
【专利摘要】本发明公开了一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。本发明从烟叶表面分离获得降解甾醇的微生物，利用种子培养基进行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇总降解率达到35.5%。甾醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。
【IPC分类】A24B15/20, C12N1/20
【公开号】CN105349478
【申请号】CN201510974135
【发明人】叶建斌, 杨雪鹏, 郝辉, 闫记, 刘向真, 杨宗灿, 马科, 毛多斌
【申请人】郑州轻工业学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月23日