用于防治妇女泌尿生殖道感染的弯曲乳酸杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及弯曲乳酸杆菌及其应用，特别涉及用于防治妇女 泌尿生殖道感染的弯曲乳酸杆菌。
【背景技术】
[0002] 泌尿生殖道感染是严重影响广大妇女身心健康的常见病，多是大肠杆菌或金黄色 葡萄球菌感染，患病率高达40% ;其治疗主要依靠抗生素，但治愈率偏低，复发率可达40% 以上。
[0003] 为了降低泌尿生殖道感染的复发率，临床上急需新的治疗方案。由于抗生素治疗 泌尿生殖道感染效果欠佳和抗生素治疗引起的肝、肾损害等毒副作用，国内外一直在努力 探索基于益生菌乳杆菌制剂的微生态疗法。微生态治疗是将以杀灭微生物为主要的治疗方 法变为增加益生菌、恢复阴道正常微生态环境为目的的新型治疗理念。即在利用抗生素清 除致病菌后，直接补充自健康妇女阴道分离的乳杆菌活菌制剂，使其粘附定植下来，促进其 天然的抵抗致病菌生长的能力。
[0004] -个完善而有效的益生菌菌种，其本身至少必须具备下述标准：（1)须为宿主应 用位置正常定植菌；（2)能在宿主应用位置存活并生长；（3)可提供宿主有益的作用；（4) 相关产品制成及储存期间须可维持活性及存活能力。
[0005]目前，国内阴道益生菌菌剂只有一种，其主要成分是德氏乳杆菌活菌。虽然它是从 健康妇女阴道分离出来的一种乳杆菌，但不是我国妇女阴道菌群中的正常定值菌。
[0006] 妇女阴道内可存在多种细菌，其中，乳酸杆菌是维持阴道健康微生态环境最常见 和最重要的有益菌，乳酸杆菌占健康妇女阴道细菌总量的90%以上。它们主要通过产酸、过 氧化氢抑制病原菌和其他条件致病菌的生长。如果某些因素引起阴道内乳杆菌数量减少， 甚至完全缺失，则可导致阴道内许多条件治病菌异常增殖，并移行至尿道引发泌尿生殖道 感染。
[0007] 健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，近期研究证实健康妇女阴道菌群中具有保护作 用的优势菌株是弯曲乳杆菌，弯曲乳杆菌各株间抗致病菌能力差异明显，具有个体差异性， 因此，选择乳杆菌益生菌时，需要综合考虑乳杆菌的种类，其产酸、抑菌能力，及与阴道上皮 细胞粘附的能力，其中乳酸杆菌能否在阴道成功定植，是乳杆菌持续作用的基础，也是乳杆 菌发挥疗效的关键因素。
[0008] 由于不同的弯曲乳杆菌株对阴道上皮细胞有不同的粘附亲和力，亲和力强的菌株 定植能力强，才能起到抑杀多种病原微生物的作用。如果乳杆菌活菌制剂不能定植在阴道 上皮细胞，体外实验中再强的抑杀多种病原微生物的作用都无从谈起，变为空头支票。
[0009] 从健康妇女阴道中分离了百余株弯曲乳杆菌，并从中筛选出既能高效拮抗妇女生 殖道致病菌，又和阴道上皮细胞具有较高粘附能力的菌株；如用这些优选的菌株研制乳酸 杆菌制品，将会克服目前临床使用的妇科乳酸杆菌制品的不足，改善妇女泌尿生殖道感染 的治疗效果。
[0010] 考虑到我国庞大的泌尿生殖道感染患病人群和阴道优势乳杆菌的扶正祛邪的作 用，妇科用乳杆菌制剂开发的市场前景极其光明。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的是提供一株弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25。
[0012] 本发明提供的一株弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,其保藏号 CGMCCN0. 11344。
[0013] 上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备预防和/或治疗 泌尿生殖道感染产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0014] 上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备抗菌产品中的应 用也是本发明保护的范围。
[0015] 上述应用中，所述菌为细菌，所述细菌具体为金黄色葡萄球菌。
[0016] 上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备粘附阴道上皮细 胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0017] 本发明另一个目的是提供一种预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品。
[0018] 本发明提供的产品，其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或 其培养液。
[0019] 本发明第三个目的是提供一种抗菌产品。
[0020] 本发明提供的抗菌产品，其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬 液或其培养液。
[0021] 上述产品中，所述菌为细菌，所述细菌具体为金黄色葡萄球菌。
[0022] 本发明第四个目的是提供一种粘附阴道上皮细胞产品。
[0023] 本发明提供的产品，其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或 其培养液。
[0024] 上述产品为药物或菌剂。
[0025]HC-25于2015年9月9日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCN0. 11344， 分类命名为弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)。
[0026] 本发明根据益生菌菌种的公认标准，从我国健康妇女体内离了阴道内优势菌群一 弯曲乳杆菌，并从中筛选出了一株具有较高抑菌能力和与阴道上皮细胞粘附定植能力强的 益生菌株一弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25。实验证明，将所述弯曲乳杆 菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,按照106cfu/ml的密度接种于MRS液体培养基，于 厌氧环境下，37°C静置培养21h的发酵液，可有效抑制金黄色葡萄球菌等致病菌的生长；对 阴道上皮细胞较强的粘附作用保证了菌株在阴道上皮的定植。
【附图说明】
[0027] 图1为从健康人阴道分离的弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25抑制 金黄色葡萄球的生长。
[0028] 图2为弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25与阴道上皮细胞的粘附作 用。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 实施例1、弯曲乳杆菌菌株的分离和鉴定
[0032] -、弯曲乳杆菌菌株的分离
[0033]MRS培养基：蛋白胨10. 0g;牛肉膏10. 0g;酵母膏5. 0g;柠檬酸氢二铵2. 0g;葡萄 糖 20. 0g;吐温 80,1.OmL;乙酸钠（CH3C00Na· 3H20) 5. 0g;磷酸氢二钾（K2HP04 · 3H20) 2. 0g; 硫酸镁（MgS04 · 7Η20)0· 58g;硫酸锰（MnS04 ·Η20)0· 25g;蒸馏水lOOOmL;调至pH6· 2 ~ 6. 6〇
[0034] 收集了 200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品，将样本 依次编号，接种于MRS液体培养基，37°C厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。扩增细菌用于细菌保种与DNA制备。 将分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定、抑制金黄色葡萄球生长及与阴道上皮细胞粘附 作用的检测，把其中一株具有较强粘附作用且有效抑制金黄色葡萄球的生长的弯曲乳杆菌 命名为MC-25。
[0035] 二、弯曲乳杆菌菌株的鉴定
[0036] 1、形态学鉴定
[0037] 在MRS乳酸杆菌培养基平板上，上述步骤一分离得到的菌株頂C-25表现为大小约 1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定。
[0038] 2、生理生化特征分析
[0039] 菌株頂C-25兼性厌氧，生长最适温度37-42°C，最适ρΗ5· 8-6. 2。根据API细 菌鉴定标准利用API50CHL培养基和API50CH试剂条（bioMe'rieux，Inc.，Marcy l'Etoile，France)对检测菌株頂J-1进行糖发酵反应判读检测菌株頂C-25的生理生化特 征。API50CHL是由49种可发酵碳水化合物的API50CH试验条组成的简易培养基。以测 定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使 指示剂变色。
[0040] 结果显示，菌株MC